宋冰冰 赵飞 王黎明
［摘要］ 目的 探讨轴蛋白（AXIN）与β－连环蛋白（β－catenin）在卵巢子宫内膜异位症（OE）恶变过程中的表达及临床意义。
方法 采用定量酶联免疫吸附试验（ELISA）及免疫组化方法，检测30例OE组织、17例非典型子宫内膜异位症（aEM）组织及30例子宫内膜异位症相关性卵巢癌（EAOC）组织中AXIN与β－catenin的表达情况，并分析β－catenin及AXIN与EAOC病人的年龄、FIGO分期、病理组织类型、肿瘤侧别等临床特征的关系。
结果 免疫组化检测显示，AXIN在OE组、aEM組、EAOC组的阳性表达率分别为76.7%（23/30）、41.2%（7/17）、30.0%（9/30），差异有统计学意义（χ2=13.852，P<0.05）；
β－catenin在OE组、aEM组、EAOC组的阳性表达率分别为13.3%（4/30）、29.4%（5/17）、63.3%（19/30），差异有统计学意义（χ2=16.661，P<0.05）。ELISA检测显示，AXIN在OE组、aEM组、EAOC组的表达水平逐渐降低，差异有统计学意义（F=1 986.939，P<0.001）；
β－catenin在OE组、aEM组、EAOC组的表达水平逐渐升高，差异有统计学意义（F=7 361.889，P<0.001）。EAOC病变组织中AXIN与β－catenin的表达呈负相关（r=－0.86，P<0.05）；
AXIN及β－catenin的表达与肿瘤FIGO分期、组织学分级有显著相关性（P=0.000～0.013）。
结论 AXIN低表达与β－catenin高表达可能参与了OE的恶变过程，且可能促进了EAOC的浸润转移。
［关键词］ β－连环蛋白；
轴蛋白质；
卵巢疾病；
子宫内膜异位症；
卵巢肿瘤
［中图分类号］ R588.6;R737.31
［文献标志码］ A
［文章编号］ 2096－5532（2023）02－0282－05
doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.044
［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］
科恶性肿瘤死亡率的首位，严重威胁着全球女性的健康。因此，探索卵巢癌可能的发病机制并探求其有效的临床治疗方法尤为重要。目前，卵巢子宫内膜异位症（OE）发生恶变的机制尚不明确，可能与某些信号转导通路因子的异常表达有关。轴蛋白（AXIN）与β－连环蛋白（β－catenin）分别为Wnt经典信号转导通路中重要的抑癌因子与致癌因子，二者在胃癌、肺癌、肝癌等多种人体癌症的发生、发展及转归中起重要作用，但二者在OE恶变过程中的作用尚不清楚。本研究检测AXIN、β－catenin在OE、卵巢非典型子宫内膜异位症（aEM）和子宫内膜异位症（EM）相关性卵巢癌（EAOC）组织的表达情况，旨在探讨二者在OE恶变过程中发挥的作用。
1 材料和方法
1.1 标本及其来源
收集2014年4月1日—2017年4月1日青岛大学附属医院诊治的EAOC病人的术后标本共30例，其中22例为卵巢子宫内膜样腺癌、8例为卵巢透明细胞癌，病人年龄为30～68岁，平均（50.53±7.78）岁；
aEM病人术后组织17例，病人年龄30～54岁，平均（47.06±6.52）岁；
OE病人术后组织30例，病人年龄为30～62岁，平均（48.03±7.29）岁。所有病人术前均未接受化疗、激素类药物治疗、放疗、中医治疗，所有组织标本均经病理检查确诊。新鲜标本获取后，一部分立刻应用40 g/L甲醛固定24 h，浓度梯度乙醇脱水后行完整石蜡包埋，连续切片（厚度为4 μm）；
另一部分组织用已预冷的1×PBS溶液充分冲洗，去除其中残留血液，称质量后剪碎，放入烧杯中，加入含蛋白酶抑制剂的PBS溶液（体积比1∶9），充分混匀，在冰上充分研磨，应用超声波细胞破碎仪进一步处理。将得到的匀浆以7 254 r/mim离心10 min后，用无菌EP管分装，放置－80 ℃冰箱保存备用。
1.2 主要试剂及仪器
兔抗人AXIN多克隆抗体、兔抗人β－catenin多克隆抗体均购于北京博奥森生物技术有限公司，根据使用说明配制试剂，抗体稀释度为1∶100；
DAB显色试剂盒、PBS缓冲液等均购于北京中杉金桥生物有限公司；
人AXIN酶联免疫吸附试验（ELISA）测定试剂盒、人β－catenin ELISA测定试剂盒均购于上海茁彩生物科技有限公司；
离心机（北京白洋器械有限公司）；
多功能酶标仪（美国 BIO－RAD公司产品）；
包埋机（德国 Leica EG1150H）；
电子天平（上海良平仪器仪表有限公司，FA1004）等。
1.3 AXIN、β－catenin蛋白表达检测
采用免疫组化方法检测AXIN和β－catenin蛋白的表达，按照常规实验流程进行操作，抗体严格按照试剂盒说明书进行稀释。阴性对照采用PBS替代一抗，阳性对照采用已知食管癌阳性标本。采用ELISA方法检测样本组织中AXIN、β－catenin的浓度，严格按照试剂盒说明书进行操作，用酶标仪检测标本光密度（OD）值，按照所配置的标准品浓度以及所测得的标准品OD值绘制标准曲线，计算AXIN、β－catenin的浓度。
1.4 免疫组化结果判读标准
AXIN蛋白阳性主要定位在细胞核和（或）细胞膜，阳性表达为出现褐黄色染色颗粒；
β－catenin蛋白阳性主要定位在细胞浆和（或）细胞核，阳性表达为出现褐黄色染色。按照SHIMIZU等的方法，综合所选视野中阳性细胞百分比以及阳性细胞染色强度确定样本蛋白的表达水平。①染色强度评分：无（或不清楚）染色为0分，染色淡黄褐色为1分，染色棕黄色为2分，染色深褐色为3分。②阳性细胞百分比评分：阳性细胞数<10%为0分，阳性细胞数10%～25%为1分，阳性细胞数26%～50%为2分，阳性细胞数＞50%为3分。根据染色强度与阳性细胞百分比得分乘积判定结果：0～1分为阴性（－），≥2分为阳性（+）。所有样本的染色结果均由两名经验丰富的病理科主任医师采用双盲法进行诊断。
1.5 统计学处理
采用SPSS 22.0软件进行统计学处理，计量资料先用Shapiro－Wilk检验进行正态性分布分析，符合正态分布计量资料用±s表示，多组数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法，α（α/3）<0.016 7表示差异有统计学意义。多组计数资料比较采用R×C表卡方检验，两个独立样本比较采用Pearson卡方、连续性校正卡方或Fisher检验。相关性分析采用Pearson相关或Spearman相关性分析。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 不同組织中AXIN、β－catenin表达比较
免疫组化检测结果显示，AXIN表达于细胞核和（或）细胞膜，且所有检测样本组织中均有不同程度的表达（图1），AXIN在OE组、aEM组、EAOC组中的阳性表达率逐渐下降，除aEM组与EAOC组比较差异无统计学意义外，余各组间差异均有统计学意义（χ2=13.852，P<0.05）；
β－catenin表达于细胞核和（或）细胞浆，且在所有检测样本组织中均有不同程度的表达（图2），β－catenin在OE组、aEM组、EAOC组中的阳性表达率呈逐渐升高的趋势，除aEM组与OE组比较差异无统计学意义外，其余各组间比较差异均有显著意义（χ2=16.661，P<0.05）。见表1。
2.2 各组AXIN、β－catenin浓度比较
各组AXIN、β－catenin浓度差异有显著性（F=1 986.939、7 361.889，P<0.01），OE组、aEM组、EAOC组AXIN的浓度逐渐降低，各组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.016 7）；
OE组、aEM组、EAOC组中β－catenin浓度依次升高，各组间两两比较差异均具有统计学意义（P<0.016 7）。见表2。
2.3 AXIN、β－catenin表达与EAOC临床病理特征的关系
EAOC组织中AXIN、β－catenin的表达与病人年龄、肿瘤侧别及组织学类型无明显相关性（P>0.05），但与临床FIGO分期和组织学分级有显著相关性（P=0.000～0.013）。见表3。
2.4 EAOC组织AXIN与β－catenin表达的相关性
EAOC组织AXIN与β－catenin表达呈负相关（r=－0.86，P<0.05）。见表4。
3 讨论
EM为临床最常见的妇科良性疾病之一，育龄期女性中其发病率可达10%～15%，全世界范围内约有1.76亿妇女受到影响，其临床特点包括不孕、盆腔疼痛、多次手术以及对病人社会心理健康和生活质量产生严重的负面效应。EAOC病人的发病年龄较低，临床分期较早，预后好，早发现、早治疗尤为重要。
EM恶变率为0.7%～1.0%，其中80%发生于卵巢，为卵巢癌已知的高危因素之一。
早在1952年就有研究论述了EM与卵巢癌之间的关系，提出并制定了EAOC的诊断标准；
随后，有研究于1953年对其诊断标准给予了进一步补充，并一直沿用至今。OE的存在使卵巢癌发生的风险增加了4倍。目前，部分国外学者认为，组织病理学上的“aEM”是EM恶变的中间过渡阶段，也是EM恶变的关键性证据之一。本研究通过对OE恶变过程中Wnt信号通路中相关生物因子变化的分析，为OE恶变的早期诊治提供依据。
Wnt家族是一个与诸多细胞功能相关的蛋白家族，参与调控器官形成、干细胞自我更新、细胞增殖和凋亡等生物过程。目前研究表明，Wnt信号转导通路在人类机体发育过程中起重要作用，可促进细胞的增殖、分化以及黏附等过程，Wnt/β－catenin经典信号通路具有促进卵巢上皮癌发展的作用。该途径也可促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，诱导肿瘤细胞抵抗治疗药物，并可能参与肿瘤组织的血管生成和免疫抑制。Wnt/β－catenin信号通路失调可能导致肿瘤的形成及肿瘤的复发。近年来有研究发现，Wnt信号通路的相关因子参与了OE的发生。但该通路是否参与OE的恶变过程尚不清楚。通过检测Wnt信号通路的关键因子在OE恶变过程中的表达，进而了解该通路是否参与OE恶变的发生，并在临床上结合OE病理切片图像中aEM病变组织的出现，可以为EAOC的早期诊治提供新思路。
β－catenin是经典Wnt通路的重要递质，它能够有效促进癌细胞的迁移、侵袭及增殖等，并能够明显阻断癌细胞的凋亡。在缺乏Wnt配体的情况下，β－catenin可以被酪蛋白激酶1（CK1）、AXIN、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）等组成的复合物所降解。
NGUYEN等研究发现，16%～54%的OE病人发生了β－catenin蛋白基因CTNNB1突变，进而导致β－catenin表达上调。而GOLDSBERRY等对DC小鼠生物模型的研究结果也显示，因体内缺乏β－catenin，小鼠卵巢肿瘤的生长速度较慢。
本研究发现，β－catenin在OE恶变过程中的表达明显增加，其浓度在OE组、aEM组、EAOC组依次升高。说明Wnt信号通路可能参与了OE恶变的过程，提示β－catenin可能为OE恶变潜在的生物指标之一。本研究对EAOC病人相关临床病理特征分析发现，β－catenin蛋白高表达与病人的FIGO分期、组织学分级显著相关，β－catenin高表达促进了EAOC的侵袭与转移。因此，未来在EAOC的临床诊治过程中，可对β－catenin高表达者予以更为积极的手术及化疗方案。
AXIN是一种支架蛋白，它与多种蛋白质（包括GSK3β、CK1等）具有相互作用的位点。AXIN在Wnt信号转导通路中对β－cantenin的降解起到至关重要的作用。既往研究显示，AXIN2基因沉默可通过调节线粒体相关凋亡信号通路从而减少细胞的凋亡，并通过调节细胞中Wnt/β－catenin信号通路的分子来增强细胞的增殖。本研究结果显示，AXIN在OE恶变过程中的表达呈明显降低的趋势，提示Wnt信号通路可能参与了OE恶变的发生，并且与aEM发展为EAOC的过程有关，AXIN可作为监测OE恶变的潜在的参考指标。本文研究结果还显示，AXIN表达与EAOC病人的FIGO分期、组织学分级显著相关；
EAOC组织中β－catenin、AXIN表达高度负相关，提示β－catenin、AXIN可能在EAOC的发生、侵袭、转移过程中起互相拮抗的作用。
近年来，随着对Wnt信号通路研究的深入，国内外学者也在其他恶性肿瘤中发现了AXIN与β－catenin的异常表达。YU等研究显示，乳癌细胞中AXIN2低水平表达导致Wnt/β－catenin信号转导通路异常，从而致乳癌的发生。YAMAMOTO等通过对174例直肠癌根治术后病人研究显示，在Wnt信号通路中，AXIN可通过将β－catenin磷酸
化而下调其表达水平，抑制Wnt信号通路的激活，从而降低结直肠癌的发生发展。梁仁杰等研究表明，胃癌中AXIN可与突变型p53相互作用，降低β－catenin的表达，从而协同发挥肿瘤抑制因子的作用。本研究结果与上述研究结果相一致。
综上所述，在OE、aEM、EAOC组织中β－catenin阳性表达率依次升高，而AXIN阳性表达率依次下降，提示Wnt信号通路可能参与了OE恶变的过程，且AXIN与β－catenin可能为OE癌变过程的重要因子，发挥着关键性的生物学作用。AXIN和β－catenin可能成为OE恶变早期诊断的潜在生物学指标，在临床上结合病理组织学检测结果，可以为EAOC病人的早期诊疗提供指导。
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（本文编辑 黄建乡）
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