陈庆峰，余 哲，黄诗琪，姚杜旸，陈 威*，王宗平
(1.武汉科技大学 城市建设学院,湖北 武汉 430065；
2.华中科技大学 环境科学与工程学院,湖北 武汉 430074)
菌藻共生好氧颗粒污泥(algal-bacterial granular sludge, ABGS)中的微藻在光合作用下产生O2，为细菌分解有机物提供溶解氧，因而较于好氧颗粒污泥(aerobic granular sludge, AGS)[1]，ABGS具有有机物处理效能高、节能降耗等优点，适用于污水处理技术[2-5]。而目前，仅有少量文章报道ABGS稳定性与结构性较好的成因[2]。
目前，我国污水处理厂主要采用生物法进行处理，采用的工艺主要有SBR工艺[6-7]、A/O工艺以及A2/O工艺[8-9]等，其污泥特性对处理效果影响较大。为形成耦合性强、沉降性能好的ABGS，探究ABGS的形态特征，在现今关于ABGS的理化性质与形成机理的研究基础上[2,10-13]，结合分形理论对ABGS进行研究有较大意义。目前对于污泥的分形特征研究具有较完善的方法，例如：张树军等[14]研究了序批式生物反应器(sequencing batch reactor, SBR)中不同粒径成熟AGS的分形特征，发现分形维数可以表征不同粒径AGS的密实度和形态特征；
郝凯越等[15]利用SEM图像，分析活性污泥(activated sludge, AS)的分形维数，发现AS结构越复杂，盒维数值越大，AS所含微生物也越难辨认；
高景峰等[16]发现分形维数能很好地表征污泥的密实程度和规则程度；
Jin等[17]研究发现分形维数可以用于研究AS的沉降性能，其值与SVI(sludge volume index)呈负相关；
Li等[18]研究表明分形维数可以用来在污水厂中作为控制AS沉降性能的关键指标。前人着重于研究AS和AGS的分形特征，但缺少关于ABGS的分形特征研究。因此，在SBR工艺下，结合分形理论对ABGS的去除效能与形态特征进行研究，具有较大理论与现实意义。
盒维数法作为分形维数计算方法之一，适用于欧氏空间。本研究采用盒维数的分形特征研究方法，使用MATLAB软件进行计算，结合扫描电镜(SEM)图像，探讨ABGS分形维数与曝气周期的关系，为解析ABGS降解污染物机理与培养优质ABGS提供理论依据。
1.1 实验装置和运行条件
实验中接种微藻为BG-11培养基扩大培养下的成熟小球藻，叶绿素a含量约为9 mg/g。接种污泥为絮状污泥，取自武汉市某污水厂，颜色呈浅褐色。该污泥的污泥体积指数(SVI5)约为80 mL/g，颗粒污泥浓度约为4 000 mg/L，平均粒径约为75 μm，初始MLVSS/MLSS(mixed liquid volatile suspended solids, MLVSS; mixed liquor sespended solid, MLSS)比值为0.615±0.003。
实验装置为3组(分别是R1、R2和R3)序批式光生物反应器(photo-sequencing batch reactor, PSBR)，反应器内径20 cm，高60 cm，有效容积18 L，用光强度为3 000±20 Lux的LED灯带包裹，色温为6 500 K，实验环境较暗，为保证较高水平的溶解氧[19]，照明持续24 h，并采用SBR工艺，水力停留时间(hydraulic retention time, HRT)为12 h，换水时间为10 min。其中，为减少运行能耗，工艺中采用的间歇曝气均为底部曝气方式[20]，曝气阶段曝气量2 L/min，3组反应器的曝气周期分别为：R1 曝气5 min，停5 min；
R2 曝气2 h，停2 h；
R3 曝气2 h，停10 h。
为保证实验的可行性，模拟市政污水水质[13](见表1)作为工艺进水水质，其中的碳源、氮源、磷源分别用葡萄糖、NH4Cl[21]、K2HPO4/KH2PO4代替。通过每日对进水出水的水质检测，改变药品的投加量，平衡水中COD、TN、TP浓度，并通过添加NaHCO3，调节反应器中pH=7.5±0.3。此外，通过分析污泥的MLVSS/MLSS值，以其值稳定且大于0.65[22]来判断ABGS是否成熟。
表1 模拟市政污水水质组成Tab. 1 Water quality composition of simulated municipal sewage
1.2 分析项目和方法
ABGS的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)中蛋白质(PN)采用快速Lowry 法试剂盒(Improved-Lowry)2000T测定，标准样品为牛血清蛋白。多糖(PS)含量采用蒽酮-浓硫酸法测定，标准样品为干燥12 h后的无水葡萄糖。ABGS形成过程中，部分小球藻被絮状污泥吸附，游离小球藻被水排出，即可通过测量反应器中的叶绿素a浓度来判断微藻吸附情况，当叶绿素a含量下降至稳定时，表明微藻含量已达到稳定，稳定后数据反映ABGS中叶绿素a含量[10,24]，采用分光光度法测量。
ABGS的粒径由激光粒度分布仪(BT-9300H)测定，ABGS的SEM图像由扫描电子显微镜(Zeiss Gemini 300)进行拍照。实验数据采用SPSS软件进行方差分析(ANOVA)。
1.3 分形维数的理论计算
ABGS的形状复杂且不规则，分形维数可定量表征不规则物质形态，已运用于研究AS结构与性质[25-27]。其中，盒维数应用覆盖法，计算简单，易于程序化[15]，盒维数D的定义是将SEM图像置于均匀分割的网络上，用边长为ε的盒子进行覆盖，表达式为：
式中N(ε)为覆盖图像所需最少盒子数。盒维数的精度与ε成负相关，为使分形维数的数据高精度，基于改进后的盒维数算法[28-30]，使用MATLAB编程，分析处理后的SEM图像，得到R1、R2和R3中ABGS的分形维数。先对图像中所需区域与背景分离，降低噪声干扰，然后将RGB图像转化得到二值反转图像。图像处理后，将盒维数法程序化，将图像转化为图像矩阵，划分成元胞数组，对不同尺度下的元胞数组进行数据处理，将盒子数与盒子尺寸进行曲线拟合，得到分形维数。
2.1 ABGS的泥质指标分析
实验期间，MLVSS/MLSS比值变化如图1(a)所示。在培养初期(1～21 d)，R1、R2和R3中的MLVSS/MLSS比值呈显著增加趋势，ABGS中有机固体物质占比增大。其中，与R1、R2相比，R3中ABGS的增长较慢。第70 d时，3个反应器中MLVSS/MLSS比值均趋于稳定，达到0.830±0.002，表明反应器中ABGS已成熟，降解能力达到稳定。
图1 ABGS形成过程中理化性质变化情况Fig. 1 Changes in physical and chemical properties of ABGS formation
图1(b)中，3个反应器中叶绿素a含量在培养初期呈逐渐下降趋势，在第21 d时，叶绿素a含量趋于稳定，R1、R2和R3中ABGS的叶绿素a含量分别为3.826、3.795和2.768 mg/g，R3中ABGS形成的微藻含量较少。成熟时期(第70 d)R1、R2和R3中ABGS的平均粒径分别为118.34、122.14和91.49 μm，且R1的粒径较为集中(图1(c))。此外，R1和R2的SVI5分别为40.1和39.5 mL/g，而R3的SVI5为45.4 mL/g，沉降性能较差，R1和R2中形成的ABGS吸附性强，具有一定的密实度。实验数据表明，曝气量影响ABGS的粒径大小和沉降性，低曝气量会造成形成ABGS时，没有提供充足的水力剪切力，减缓ABGS的形成且造成成熟ABGS沉降性差，在相同且较高水平的曝气量下，短周期形成的ABGS粒径略大且集中。其中，低曝气量主要减缓颗粒污泥的吸附性，对微藻与细菌结合速率无明显影响。
2.2 ABGS的去除效能分析
在ABGS形成期间，细菌的生物活性逐渐恢复，去除效率增强。为准确探究分析ABGS的生物活性，将进水COD、TN和TP分别维持在200±40、45±10和4±1.5 mg/L，其中碳氮比约为4.44，碳磷比约为50，并计算ABGS形成后的COD、TN、TP去除率。如图2所示，随着ABGS培养，R1、R2和R3的COD、TN、TP去除率均有明显增加(P<0.05)，且出水COD、TP浓度达到城市污水排放一级A标准[31]，而TN去除率不足40%，去除率较差。
图2 R1、R2和R3中COD、TN、TP去除率变化Fig. 2 COD, TN, and TP removal rate changes in R1, R2 and R3
污染物进出水浓度见表2。由表2可见，在第70 d末期，R1和R2的出水COD分别达到13.16±2.26和14.08±4.44 mg/L，两者的显著性检验数值P>0.05，无显著性差异；
R3中出水COD为26.52±5.08 mg/L，比 R1、R2高，但COD去除效能仍处于较高水平，达到IV类水体的COD标准[32]。其中小球藻在光合作用下提供异养菌降解COD所需氧气[13]，这些异养菌在好氧条件下分解葡萄糖[33]，从而促进ABGS对COD的去除效果。在相同曝气量下，间歇时间(≤2 h)对ABGS的去除效果影响较小，表示在停止曝气阶段ABGS中小球藻产生O2，溶解氧达到0.4±0.1 mg/L，使ABGS能维持去除效能，而R3中间歇时间较长，但溶解氧仍达到0.35±0.1 mg/L。
表2 污染物进出水浓度Tab. 2 Pollutant inlet and outlet water concentration
此外，由于水质的低碳氮比(C/N小于5)[34]，造成R1、R2和R3中TN去除率较低。而氮源充足条件下，ABGS具有良好的脱氮效能[2]。随着ABGS成熟，增大颗粒内部的厌氧区，加强了ABGS中反硝化细菌的反硝化作用，增大TN的去除效果。相较于R3，R1和R2中ABGS的微藻含量高，促进氮的同化作用，提高TN去除率。而R3的低密实度，造成部分ABGS解体，抑制反硝化作用。且在ABGS中，聚磷菌(PAO)在好氧和缺氧下过量吸磷，微藻发生光合磷酸化将无机磷同化吸收，同步提高TP去除率。其中，R3的TP去除率明显小于R1和R2，说明藻类含量有效促进ABGS中TP的去除效能，提高ABGS中藻类含量，有助于实现TP高效去除。
2.3 ABGS中EPS成分含量分析
在成熟ABGS稳定性方面，EPS起到重要作用，EPS含量越高，细菌结合越紧密，ABGS越稳定[2]。为分析曝气周期对ABGS形成中EPS的影响，检测R1、R2和R3中初始和第70 d的PS和PN含量。
由实验数据(图3)所示，R1、R2和R3中初始EPS浓度基本相等，在ABGS成熟时PS浓度基本不变，PN浓度上升，在ABGS形成过程中，PN增加有助于ABGS形成。在R1和R2中，R2的PN含量略小于R1，说明短周期曝气有助于维持ABGS稳定性，但影响较小。此外，R2中可挥发性固体悬浮物中PN含量达到9.32 mg/g，PN/PS为3.91。而R3中胞外聚合物较少，可挥发性固体悬浮物中PN含量为7.35 mg/g，表明曝气量在低水平下PN含量较低，成熟的ABGS稳定性较差。
图3 R1、R2和R3中的PS和PN含量变化Fig. 3 PS and PN content changes in R1, R2 and R3
附着性EPS由LB-EPS和TB-EPS组成，图4为LB-EPS和TB-EPS的3D-EEM图。LB-EPS图中含有一个特征峰(峰Ⅰ)，峰Ⅰ的Ex/Em大约在220/290 nm处，该区域代表的有机物为芳香族蛋白质Ⅰ，且特征峰不明显，表明LB-EPS含量较小。TB-EPS图中含有2个特征峰(峰Ⅰ和峰Ⅱ)，峰Ⅰ的Ex/Em大约在280/350 nm处，该区域代表的有机物为色氨酸类蛋白质，峰Ⅱ的Ex/Em大约在220/300 nm处，该区域代表的有机物为芳香族蛋白质Ⅰ。此外，LB-EPS荧光强度小于TB-EPS，且R3中LB-EPS的荧光强度小于R2，表明较高水平曝气量，促进ABGS分泌TB-EPS。
图4 成熟ABGS中LB-EPS和TB-EPS的三维荧光光谱Fig. 4 3D-EEM fluorescence spectra of LB-EPS and TB-EPS in mature ABGS
随着ABGS的成熟，ABGS中LB-EPS(loosely bound EPS)和TB-EPS(tightly bound EPS)均增加，有助于维持EPS稳定性[35]。此外，R1和R2中TB-EPS PN含量明显高于R3，表明较高水平曝气量有助于ABGS中TB-EPS增加，微生物分泌的EPS含量越高，说明ABGS的密实度越好。
3.1 SEM图像分析
为探究ABGS的物理结构，采用成熟的ABGS进行分形特征分析，取反应器中第60 d的ABGS进行电镜扫描，图5为扫描电镜获取的ABGS图像与处理图像。由图像可知，R1和R2中ABGS的表面含有大量杆菌、球菌和少量的丝状菌，且颗粒污泥表面较为平整，而R3中ABGS的表面球菌和杆菌含量降低，表明低曝气量抑制部分球菌和杆菌生长。在R3中ABGS的表面有裂隙，说明低曝气量下AGS的吸附不均匀，且吸附性较差，造成成熟的ABGS在正常的水力剪切力下具有低稳定性[36]。
图5 R1、R2和R3反应器中ABGS的SEM以及处理图像Fig. 5 SEM images and image processing of ABGS in R1, R2 and R3 reactors
3.2 ABGS的分形维数计算
为进一步探究ABGS的形态特征，借助MATLAB软件计算其分形维数。为验证程序准确度，分别将Sierpinski三角形图像和Sierpinski地毯图像作为输入图像，计算得到分形维数的实际值分别为1.578 9和1.884 2，误差小于5‰，误差较小，表明MATLAB程序具有可行性，可分析处理后的SEM图像，计算得到R1、R2和R3中ABGS的盒维数分别为1.817±0.041、1.828±0.044和1.787±0.038，R1和R2的分形维数相近且形态结构相似，R3的分形维数小于R1、R2，说明R3稳定性差。
R1和R2在ABGS培养第60 d的COD、TN、TP去除率相近，且R1、R2和R3中MLVSS/MLSS比值和EPS含量相近，表明R1和R2所形成的ABGS的理化性质相近，R3中ABGS的沉降性能和稳定性较差。此外，R3的去除效能明显小于R1和R2，说明曝气周期对去除率有明显影响，短周期曝气对ABGS的稳定性有一定的促进作用，低水平的曝气量不能提供充足的O2，造成载体不稳定现象，不适用于运用ABGS的污水处理工艺。
通过对比ABGS与其他污泥的分形维数发现，未接种微藻的AS分形维数为1.07～1.68[18]，ABR颗粒污泥的分形维数为1.80～2.05[37]，好氧颗粒污泥分形维数为1.77～1.90[16]。不同曝气周期下形成的菌藻共生污泥的SEM照片呈现出不同的污泥结构和微生物种类，这是因为曝气周期充当了一种选择压，可以选择、富集特定的细菌和微藻，造成了污泥形态特征的不同。结合目前对于污泥分形维数的研究[14-18]发现，不同曝气周期下形成的菌藻共生污泥的分形维数均大于活性污泥的分形维数，且ABGS的分形维数与好氧颗粒污泥的分形维数数据相似，表明微藻的结合对污泥的分形维数提升较大，且由于污泥颗粒化，AGS和ABGS的结构更为复杂，即分形维数越大其结构越复杂、密实度越高、沉降性能越好，这与Jin等[17]研究的活性污泥沉降性能与分形维数的关系一致。
由上述R1、R2和R3的沉降性能、去除效能与分形维数数据分析，表明在该值范围内，分形维数越大，ABGS的密实度越高、沉降性能越好、去除效能越好，污泥的沉降性能、生物活性与分形维数呈正相关[14,18,37-38]。
本文采用PSBR反应器，在3组不同曝气周期下培养ABGS，反应器共运行70 d，对得到的数据进行分析运算，结论如下：
1)ABGS在低碳氮比污水处理上，具有良好的COD、TP去除率，且微藻含量有效影响TP去除与氧气能耗，ABGS工艺适用于当今污水处理技术。
2)在相同水力停留时间和相同且较高水平的曝气量下，间歇时间(≤2 h)对ABGS的沉降性能、生物活性和形态特征影响较小，且短周期曝气会促进成熟ABGS的粒径更为集中。考虑低能耗，在运用ABGS的SBR工艺下，可采用曝气2 h停2 h，以节省能耗。低曝气量影响ABGS的沉降性能和生物活性，抑制部分球菌和杆菌生长。
3)依据盒维数算法，计算得到ABGS的分形维数为1.78～1.83，与好氧颗粒污泥的分形维数相似，且分形维数能够反映ABGS的沉降性能和生物活性，ABGS的分形维数越大，ABGS的沉降性能和生物活性越好。
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