许 慧, 薛 晓, 李楷原, 刘 翠, 邓雅姗, 张媛媛
(青岛科技大学 化工学院, 山东 青岛 266042)
ε-己内酯作为重要中间体，特别是新型聚合物聚己内酯的单体，引起了广泛的关注[1].现使用的生产方法有一定的危险性与环境污染性.近年来，越来越多的研究致力于ε-己内酯合成方法的改进.脂肪酶介导的一锅法[2]从环己酮和乙酸乙酯(EtOAc)合成ε-己内酯的工艺，通常认为该反应体系由两个连续的反应组成[3-4]：1) 脂肪酶催化羧酸或酯与过氧化氢反应生成过氧乙酸；
2) 形成的过氧乙酸化学氧化酮形成内酯.本文提出另外一个反应存在于该体系中：3) 反应生成乙酸，经脂肪酶催化原位生成过氧乙酸.具体反应过程如图1所示.
图1 脂肪酶介导的环己酮氧化为ε-己内酯的反应Fig.1 The reaction of lipase-mediated oxidation of cyclohexanone to ε-caprolactone
(1)
(2)
(3)
基于Baeyer-Villiger氧化(BV氧化)的化学-酶用环己酮制备ε-己内酯的方法，通常采用过氧化氢或过氧化氢脲(UHP)作为氧化剂，T. laibacchi脂肪酶B作为催化剂，EtOAc作为酰基供体和溶剂[2-6].现有工艺的ε-己内酯的浓度很低，仅约0.225～0.370 mol/L，转化率为80%～90%，为了降低生产成本，提高过程的经济性，应该大幅度增加产物浓度，并提高转化率.采用稳定性高的酶，减少高浓度底物、产物及中介产物对酶的抑制，通过使用响应面法(RSM)优化工艺来提高产品的浓度.
为了改善酶的性质，包括稳定性、活性、选择性、对抑制剂或化学物质的抗性以及可重复利用性，酶通常被固定化[7-8].戊二醛已被广泛用作蛋白质的交联剂、载体活化剂以及脂肪酶和载体的交联剂[9].将吸附的脂肪酶与戊二醛交联，以改善脂肪酶的稳定性[10-12].本文采用戊二醛作为T. laibacchi脂肪酶和硅藻土载体的交联剂，提高脂肪酶的稳定.
本文采用固定化T.laibacchi脂肪酶介导化学-酶BV氧化法，以环己酮和EtOAc为原料，合成ε-己内酯.为提高ε-己内酯的产率，采用RSM对环己酮与UHP的物质的量比、反应温度和环己酮浓度等关键变量进行优化.首次提出并通过实验验证：该反应体系中存在三个反应，而不仅仅是两个反应.
1.1 原料
EtOAc (99.8%)、环己酮(99%)、UHP (97%)和ε-己内酯(97%)为分析纯.所用的固定化脂肪酶是交联的固定化T. laibacchii CBS5791脂肪酶(CaLB)，其酶活性为1 280 U/g，粒径为0.45 mm[13].脂肪酶的活性采用 “橄榄乳化法”测定[14].
脂肪酶催化环己酮BV氧化生成ε-己内酯.
反应在一个20 mL的反应瓶中进行，环己酮浓度范围为0.5～2 mol/L，环己酮与UHP物质的量比为0.5～2，EtOAc浓度为8.9 mol/L，固定化CaLB浓度为25 mg/mL.反应瓶在水浴振荡器中，转速200 r/min，反应温度40～70 ℃，反应时间8～12 h.从反应溶液中取出样品，进行高效液相色谱分析.
1.2 高效液相色谱分析
所用液相色谱仪为SHIMADZULC-16，色谱柱为WondaSil-WR色谱柱(250×4.6 mm,5 μm)，流动相是甲醇和水的比例为4∶6，流速为1.0 mL/min，样品注入20 μL，柱温30 ℃.ε-己内酯和环己酮的检测波长分别为210 nm和277 nm.ε-己内酯和环己酮的保留时间分别为4.9 min和8.5 min.
考虑到生产成本和酶的效率，酶浓度设定为25 mg/mL.本文采用三因素三水平Box-Behnken中心组合实验设计，确定最佳反应条件.根据初步实验结果，选择环己酮浓度(A)、底物物质的量比(B)、反应温度(C)为自变量，产物ε-己内酯的产率(Y)为响应值.使用Design-Expert 8.0.6软件，共设计15个实验点,其中中心点实验重复3次，因素和水平见表1所列.
表1 Box-Behnken测试设计的因素和水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken test design
3.1 环己酮化学-酶法氧化制备ε-己内酯的优化：RSM实验和模型拟合
RSM是一种广泛使用的最优实验设计方法，以最少的实验量建立最佳条件，并分析变量之间的交互作用[15-16].与传统的三因素三水平正交试验相比，RSM可以显著减少实验量，得出更精确的因素水平量，通过回归方程得到各因素的最佳组合.表2给出实验结果，使用Design Expert8.0.6软件建立了二次多项式最佳拟合模型(式4)，并进行了回归分析(表3)，以评估环己酮浓度(A)、环己酮与UHP的物质的量比(B)和反应温度(C)对产率(Y)的影响.
表2 RSM的设计和响应值Tab.2 Design and response values of RSM
Y=95.99+0.94A-7.4B+2.31C+3.14AB-1.93AC-1.77BC-15.46A2-6.04B2-20.87C2
(4)
由CaLB催化的环己酮化学-酶BV氧化法，制备ε-己内酯的产率，可以用方程(4)计算.式中变量的正系数表示该变量对产量有正效应，反之，负系数表示对产量有负效应.由方程(4)可见，线性项A和C以及交互作用项AB的系数为正，表明这些因素对ε-己内酯的产率有正效应；
所有二次项(A2,B2和C2)和交互作用项(AC,BC)对ε-己内酯的产率都有负效应.
表3 拟合模型的方差分析Tab.3 ANOVA analysis and variance analysis of the fitted model
3.2 不同因素对环己酮化学-酶法氧化制ε-己内酯产率的交互作用
根据模型方程绘制响应面图和等高线图，如图2～图4所示，可以直观地反映变量之间交互作用对ε-己内酯产率的影响，可方便的用于研究各变量之间的交互作用.
每个图有两个变量，第三个变量保持固定水平不变.
环己酮浓度(A)和底物物质的量比(B)对ε-己内酯产率的影响如图2所示，当环己酮与UHP的物质的量比从0.5 (1∶2)增加到0.77 (1∶1.3)时，ε-己内酯的产率是升高的，因为随着B的增加，UHP浓度降低，UHP对脂肪酶活性的抑制作用减小，使得反应加快，产率增加.当物质的量比进一步降低时，产率降低，这可能是因为UHP太少而不足以支持反应.如图2所示，当环己酮浓度从0.5 mol/L增加到1.22 mol/L时，ε-己内酯的产率增加，当环己酮浓度进一步增加时，产率降低，这是因为环己酮浓度已造成底物抑制.
图3和图4分别给出反应温度与环己酮浓度、环己酮浓度与环己酮与UHP的物质的量比的交互作用图.通常，反应温度会影响酶的活性与稳定性，影响酶的催化效率[17-18].图3中，在一定温度范围内，ε-己内酯的产率随着温度的升高而升高，当温度达到约56.5 ℃时，ε-己内酯的产率达到最大，随着温度进一步升高，ε-己内酯的产率下降.这可能是由于在56.5 ℃之前，CaLB的活性随着反应温度的升高而增加，因此ε-己内酯的产率增加[19-20]；
当温度进一步升高时，可能是由于温度过高造成CaLB部分失活以及稳定性降低，ε-己内酯的产率降低.这是因为敏感氨基酸可能被过氧乙酸氧化，导致酶失活[21]，当反应温度升至60 ℃时，较低的过氧乙酸浓度也会使脂肪酶活性也会降低[22].通常，椭圆的等高线图表明相应变量之间的交互作用是显著的，而圆形等高线图表明它们之间的交互作用可以忽略.环己酮浓度和环己酮与UHP的物质的量比(F=54.7)之间的交互作用在统计学上比反应温度和环己酮浓度(F=20.84)之间的交互作用更显著.环己酮与UHP的物质的量比和反应温度之间的交互作用与这两种交互作用相比也是显著的(F=17.39).环己酮浓度和底物物质的量比之间的交互作用、反应温度和环己酮浓度之间的交互作用对ε-己内酯的产率具有最大的影响，图2和图3的等高线图也进一步验证了这一点.
图2 环己酮的初始浓度和环己酮与UHP的物质的量比对ε-己内酯产率的影响(反应温度55 ℃)Fig.2 Effect of initial concentration of cyclohexanone and the molar ratio of cyclohexanone to UHP on the yield of ε-caprolactone (reaction temperature 55 ℃)
图3 环己酮的初始浓度和反应温度对ε-己内酯产率的影响(环己酮与UHP物质的量比1.25)Fig.3 Effect of initial concentration of cyclohexanone and reaction temperature on the yield of ε-caprolactone (the molar ratio of cyclohexanone to UHP 1.25)
图4 反应温度和环己酮与UHP的物质的量比对ε-己内酯产率的影响(环己酮的初始浓度1.25 mol/L)Fig.4 Effect of reaction temperature and the molar ratio of cyclohexanone to UHP on the yield of ε-caprolactone (initial concentration of cyclohexanone 1.25 mol/L)
环己酮与UHP的物质的量比是决定ε-己内酯产率的一个重要的因素[23]，这与研究结果一致(p<0.000 1).从表3可以看出，环己酮与UHP的物质的量比对ε-己内酯的产率影响最大(p<0.000 1),不同的物质的量比导致产率的显著变化.在环己酮与UHP的最佳物质的量比为1∶1.3时，ε-己内酯的产率达到98.06%.
在反应中，ε-己内酯、水、氧气和EtOAc对CaLB的抑制作用可以忽略，而底物UHP和副产物乙酸对CaLB有很强的抑制作用，甚至会导致CaLB失活.一般认为CaLB具有良好的稳定性，但是UHP作为氧化剂，抑制CaLB活性.因此，必须采用最佳UHP浓度，这与环己酮与UHP的最佳物质的量比有关.UHP可以使CaLB失活，因为当CaLB暴露于过氧乙酸浓度较高的H2O2中时，敏感氨基酸被氧化，这可能导致反应速率显著降低.当反应温度高于60 ℃时，即使过氧乙酸浓度很低，也能引起CaLB失活，不能用于下一次反应.CaLB失活随着时间的推移逐渐发生，最终氧化过程导致二硫键断裂和结构损失[23-24].
3.3 反应系统中存在三个反应
环己酮与UHP的物质的量比在1∶2至1∶1之间，是由反应(1)和反应(3)确定，两者都消耗UHP来产生过氧乙酸.在两个反应中，UHP的化学计量系数不同，反应(1)的化学计量系数是2，反应(3)是1.如果只发生反应(1)，则比率为1∶2,如果只发生反应(3)，比例为1∶1.实际比率值取决于反应(1)和反应(3)的贡献.本文得到的最佳物质的量比为1∶1.3，这意味着消耗的UHP和EtOAc分别为1.83 mol/L和0.61 mol/L.对于反应(1)，消耗1.22 mol/L UHP和0.61 mol/L EtOAc形成0.61 mol/L过氧乙酸，留下0.61 mol /L UHP.通过反应(2)，过氧乙酸与环己酮反应生成ε-己内酯和乙酸，后者与UHP反应原位生成过氧乙酸.反应(2)和反应(3)依次进行，直到通过反应(3)耗尽0.61 mol/L UHP，并且通过反应(2)同时形成0.61 mol/L ε-己内酯.因此，总共形成了1.22 mol/L ε-己内酯，由于转化率为98.06%，ε-己内酯的实际浓度约为1.2 mol/L.
从上述讨论可得出结论，中间产物乙酸与UHP反应，生成过氧乙酸，即反应(3)实际上发生了.这表明反应系统中有三个反应，而不是两个反应.本文首次提出，酶介导的环己酮、EtOAc反应体系中，中间产物乙酸与UHP原位反应，生成过氧乙酸.由于反应(3)的作用，最佳物质的量比为1∶1.3,UHP初始浓度从2.5 mol/L减少到1.568 mol/L，减少了0.932 mol/L，这非常有利于减少UHP对脂肪酶的抑制，增加产率.
3.4 高浓度的目标产物ε-己内酯
为了提高反应的经济性，可通过增加底物与反应物的浓度来提高产物浓度，但这会影响酶的稳定性与耐受性.在生物催化反应过程中，底物抑制会严重影响酶的活性.通过包埋和交联等固定化技术，可以增加酶的稳定性.交联固定化酶的稳定性优于吸附的固定化酶，以戊二醛为交联剂，将CaLB固定在硅藻土载体上.环己酮的初始浓度为1.22 mol/L，目标产物ε-己内酯的浓度达到约1.2 mol/L，产率为98.06%，远高于转化率80%～90%(0.225～0.370 mol/L).这是因为本文中所用的CaLB，采用交联固定化，提高了CaLB的稳定性.
3.5 最佳反应条件的确定和验证
根据RSM法得到的优化的实验条件：环己酮初始浓度为1.22 mol/L，环己酮与UHP的物质的量比为1∶1.3，温度为56.5 ℃.在此优化条件下进行了三次验证试验，ε-己内酯的产率达到98.06%，与预测值(98.42%)非常接近.这表明该模型是可靠的，可很好的关联环己酮初始浓度、环己酮与UHP的物质的量比和反应温度等变量对ε-己内酯产率的影响.
进行了固定化CaLB催化BV氧化反应制备ε-己内酯的实验，用RSM法进行了实验设计，获得了最优反应条件，产率达到98.06%，浓度高达1.2 mol/L，较其他研究有了显著提高，其原因主要是所用的交联固定化CaLB稳定性好.最优反应条件也有较大贡献，最佳反应条件：环己酮的初始浓度为1.22 mol/L，环己酮与UHP的物质的量比为1∶1.3，反应温度为56.5 ℃.结果表明，在环己酮、EtOAc反应体系中有三个反应，其中第三个反应是中间产物乙酸，在固定化CaLB的催化下与UHP反应，原位生成过氧乙酸.建立二次多项式模型，其R2值为0.998 8，可以准确地预测ε-己内酯产率.该模型考虑了环己酮的初始浓度、环己酮与UHP的物质的量比和反应温度对ε-己内酯产率的影响.结果表明，环己酮与UHP的物质的量比对ε-己内酯的产率有非常显著的影响(p<0.000 6).
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