蔡燕丽 朱锦明 张跃辉 栾晓梅 彭凤云 李青 杜长江
1徐州医科大学研究生院（江苏徐州 221006）；
2徐州医科大学附属徐州妇幼保健院（江苏徐州 221009）；
3黑龙江中医药大学附属第一医院（哈尔滨 150040）
子痫前期（preeclampsia，PE）是一种常见的、具有潜在致命性的妊娠多系统疾病，其特征是妊娠20 周后出现新发的高血压和蛋白尿，或者在没有蛋白尿的情况下出现新发的PE 相关体征［1］，该疾病在所有妊娠孕妇中的发病率为2%～7%，是孕产妇和围产儿发病率和病死率的主要原因［2］。目前普遍认为＜34 周发病者为早发型PE，≥34 周者发病者为晚发型PE［3］。PE 病因复杂，其机制尚未阐明。SCUBE2 是一个进化保守的小基因家族的第二个成员，在血管内皮细胞和非内皮细胞中广泛表达［4］。LIN 等［5］研究发现SCUBE2 可与内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）相互作用促进血管增殖、迁移。VEGFR2 是促血管生成的主要受体［6］，已被证明其与VEGF 相互作用，介导滋养细胞的侵袭和假性血管形成［7］导致胎盘重铸障碍。目前，SCUBE2 在妊娠相关疾病中鲜有研究，其是否通过VEGFR2 通路参与PE 的发生尚无相关文献报道，本研究将通过对PE 孕妇及正常足月分娩孕妇的血清和胎盘组织中SCUBE2 及VEGFR2 进行检测，研究其表达水平差异与PE 之间的关系，分析SCUBE2 与VEGFR2 之间的关系，讨论SCUBE2在PE 发生发展中的可能作用，为PE 的发病机制提供新的思路及治疗靶点。
1.1 一般资料2021 年6 月至2022 年6 月于医院住院分娩的PE 孕妇共58 例。根据其发病孕周将PE 组划分为早发型PE 组（发病孕周＜34 周）和晚发型PE 组（发病孕周≥34 周）；
并以同期足月妊娠分娩的孕妇30 例设定为对照组。三组孕妇的孕次、产次、年龄和BMI 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），分娩孕周比较，早发型PE 组分娩孕周早于晚发型PE 组及对照组（P＜0.05），晚发型PE 组与对照比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。纳入标准：临床确诊为PE 孕妇且临床资料完整；
产妇及其家属均自愿签署知情同意书；
妊娠20～40 周；
单胎自然受孕患者；
无吸烟、饮酒不良嗜好。排除标准：排除既往高血压、糖尿病病史；
辅助生殖及多胎妊娠；
有心、肝、肾、内分泌疾病及自身免疫性疾病；
其他妊娠合并症或并发症；
精神异常。所有的研究对象均征得本人书面同意并经医院伦理委员会同意。
表1 三组孕妇一般情况比较Tab.1 Comparison of the generral situation of three groups of pregnant women ±s
表1 三组孕妇一般情况比较Tab.1 Comparison of the generral situation of three groups of pregnant women ±s
注：与早发型PE 组比较，*P＜0.05
组别对照组早发型PE 组晚发型PE 组F 值P 值例数30 30 28年龄（岁）29.90 ± 3.35 31.30 ± 4.29 30.04 ± 5.26 0.939 0.395 BMI（kg/m2）27.71 ± 3.43 29.01 ± 3.19 29.30 ± 3.37 1.901 0.156孕次［M（P25，P75）］2.00（2.00）2.00（1.50）3.00（3.00）产次［M（P25，P75）］2.00（1.00）1.00（1.00）1.00（1.00）0.476 0.407分娩孕周39.00 ± 1.06*33.51 ± 2.10 38.29 ± 1.05*118.869 0.000
1.2 诊断标准PE 诊断标准：符合第九版《妇产科学》［3］。
1.3 ELISA 检测三组孕妇血清中SCUBE2、VEGFR2的表达量均于入院治疗前抽取肘静脉血4 mL，静置20～30 min，3 800 r/min 离心10 min，留取血清，标记后存放于-80 ℃冰箱，使用ELISA 法（试剂盒购江苏酶标公司）测定血清样本中SCUBE2 和VEGFR2 表达水平，使用Rayto RT-6100 酶标分析仪（深圳雷杜公司）在450 nm 波长下测定吸光度（OD值），根据标准曲线得出各样品对应浓度值。
1.4 免疫组化SP 法检测三组孕妇胎盘组织中SCUBE2 蛋白表达水平及定位免疫组化法检测胎盘组织中SCUBE2 蛋白，一抗为兔抗人单克隆SCUBE2 抗体（英国Abcam 公司）按照试剂盒说明书步骤进行操作。使用倒置显微镜（日本Olympus公司）进行观测玻片，以无着色或与背景颜色一致的为阴性细胞，胞膜、胞质及细胞核出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞，按照FROMOWITZ 等［8］综合计分法进行半定量分析，根据阳性细胞的染色范围和强度确定蛋白的表达水平。
1.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）测定三组孕妇胎盘组织中SCUBE2、VEGFR2 mRNA的表达量Trizol 法提取总的RNA，测量其浓度后并逆转录为cDNA（试剂购自日本TaKaRa 公司），随后使用LightCycler480 System（瑞士Roche 公司）进行Real Time PCR 反应（试剂购自日本TaKaRa 公司）。目的基因SCUBE2 引物序列，上游：5＇-GACGAGTGCCTGGAGAACAATGG-3＇，下游：5＇-GCAGATGTGACTACAGCCGTGATC-3＇；
目的基因VEGFR2 引物序列，上游：5＇-GACAGTGGTATGGTTCTTGCCTCAG-3＇，下游：5＇-GTGGTGTCTGTGTCATCGGAGTG-3＇。目的基因扩增40 个循环，以甘油醛-3 磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，计算相对表达量，用2-△△CT法计算各组表达水平的倍数的差异。
1.6 Western blot 法检测胎盘组织中SCUBE2、VEGFR2 蛋白量表达取80 mg 胎盘组织，加入800 μL RIPA 裂解液及8 μL 蛋白酶抑制剂（10∶100∶1），-4 ℃条件下离心20 min，取上清液，BCA法检测蛋白浓度，使用7.5% 雅酶快速制胶剂制胶，电泳、电转，5%脱脂牛奶室温封闭，加入SCUBE2 单抗（1∶500）（英国Abcam 公司）、VEGFR2 单抗（1∶500）（英国Abcam 公司）4 ℃摇床孵育过夜，洗膜3 次，加入二抗（1∶2 000）孵育，洗涤后使用ChemiDocM 凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）进行曝光，以β-tubulin 作为内参，使用Image J进行分析。
1.7 统计学方法SPSS 23.0资料分析，正态分布资料采用（）表示，在多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验；
计数资料使用（%）或例数表示，采用χ2检验；
采用Pearson分析法进行相关性分析，检验水准为P＜0.05。绘图使用Graphpad prism 8 软件。
2.1 ELISA检测结果PE组孕妇血清中的SCUBE2和VEGFR2表达量低于对照组（P＜0.05），其中早发型PE组表达量明显低于晚发型PE组（P＜0.000 1），见表2。
表2 三组孕妇血清中SCUBE2、VEGFR2 的表达量Tab.2 Expression levels of SCUBE2 and VEGFR2 in serum of three groups of pregnant women ±s，pg/mL
表2 三组孕妇血清中SCUBE2、VEGFR2 的表达量Tab.2 Expression levels of SCUBE2 and VEGFR2 in serum of three groups of pregnant women ±s，pg/mL
注：*对照组和早发型PE 组相比较；
#早发型PE 组和晚发型PE 组相比较；
△晚发型PE 组与对照组相比较
组别对照组早发型PE 组晚发型PE 组F 值P 值SCUBE2 蛋白表达量14.32 ± 2.43 9.94 ± 1.96 12.73 ± 2.34 29.14＜0.000 1 P 值＜0.000 1*＜0.000 1#＜0.05△VEGFR2 蛋白表达量784.79 ± 148.60 486.19 ± 122.64 667.15 ± 156.09 33.24＜0.000 1 P 值＜0.000 1*＜0.000 1#＜0.05△
2.2 PE 孕妇血清中SCUBE2、VEGFR2 表达水平相关性分析PE 孕妇血清中SCUBE2、VEGFR2 在孕妇血清中表达水平呈正相关（r=0.602 2，P＜0.000 1）。见图1。
图1 PE 组血清中SCUBE2 和VEGFR2 表达水平相关性散点图Fig.1 Scatter plot of correlation between serum SCUBE2 and VEGFR2 expression levels in preeclampsia pregnant women
2.3 免疫组化结果SCUBE2 蛋白主要表达于胎盘合体滋养细胞及胎盘血管内皮细胞中。3 组孕妇胎盘中SCUBE2 蛋白相对表达量比较，PE 组胎盘组织表达量低于对照组，早发型PE 组蛋白表达量低于晚发型PE 组，见表3、图2。
图2 SCUBE2 蛋白在胎盘中的表达（DAB 染色，× 400）Fig.2 The expression of SCUBE2 in placental tissues（DAB staining，× 400）
表3 三组孕妇胎盘中SCUBE2 的表达量Tab.3 Expression of SCUBE2 in placental tissues of three groups pregnant women 例（%）
2.4 三组孕妇胎盘组织中SCUBE2、VEGFR2 蛋白及mRNA 表达水平PE 组胎盘组织中SCUBE2、VEGFR2 蛋白及mRNA 表达低于对照组（P＜0.05），早发型PE组表达水平低于晚发型PE组（P＜0.05）。见图3、表4、5。
图3 三组孕妇胎盘组织SCUBE2 及VEGFR2 蛋白表达量Fig.3 The expression of SCUBE2 and VEGFR2 protein in placental tissues of three groups of pregnant women
表4 三组孕妇胎盘中SCUBE2 、VEGFR2 mRNA 表达量Tab.4 The expression levels of SCUBE2 mRNA and VEGFR2 mRNA in placental tissues of three groups of pregnant women ±s
表4 三组孕妇胎盘中SCUBE2 、VEGFR2 mRNA 表达量Tab.4 The expression levels of SCUBE2 mRNA and VEGFR2 mRNA in placental tissues of three groups of pregnant women ±s
注：*对照组与早发型PE 组相比较；
#早发型PE 组与晚发型PE组相比较；
△晚发型PE 组与对照组相比较
组别对照组早发型PE组晚发型PE组F值P值SCUBE2mRNA表达水平0.95±0.35 0.36±0.23 0.64±0.23 34.11＜0.001 P值＜0.001*＜0.001#＜0.001△P值＜0.001*＜0.001#＜0.050△VEGFR2mRNA表达水平1.22±0.43 0.35±0.19 0.90±0.49 37.50＜0.001
表5 三组孕妇胎盘中SCUBE2 及VEGFR2 蛋白表达水平Tab.5 The expression of SCUBE2 and VEGFR2 protein in placental tissues of three groups of pregnant women ±s
注：*对照组与早发型PE 组相比较；
#早发型PE 组与晚发型PE组相比较；
△晚发型PE 组与对照组相比较
组别对照组早发型PE 组晚发型PE 组F 值P 值SCUBE2 蛋白表达水平1.04 ± 0.23 0.67 ± 0.22 0.83 ± 0.18 23.25＜0.001 P 值＜0.001*＜0.050#＜0.001△VEGFR2 蛋白表达水平0.99 ± 0.32 0.52 ± 0.25 0.72 ± 0.25 22.06＜0.001 P 值＜0.001*＜0.050#＜0.001△
PE 是以高血压和尿蛋白为特征的全身性血管相关性疾病，几乎可以影响到每一个器官及系统，导致子痫前期相关不良并发症和妊娠结局，如：子痫、HELLP 综合征、肝肾功能损伤、心脑血管风险、胎盘早剥、胎儿生长受限、早产、死胎等。目前PE发病原因仍有争议，但临床和病理研究表明胎盘是该综合征发病机制的核心。正常妊娠时，血管内绒毛外滋养细胞（enEVT）进入子宫螺旋小动脉并逐渐替代血管壁内皮细胞及平滑肌细胞，使高阻力低血容量血管转变为低阻力高血容量的血管，以确保母体与胎儿之间的物质营养交换正常进行，而在PE 孕妇胎盘中，绒毛外细胞滋养层细胞侵入过浅，导致胎盘血液循环障碍、释放促炎因子、母体炎症引起内皮细胞损伤、通透性增加、及释放抗血管生成因子进入循环，如可溶性FMS样酪氨酸激酶1（sFlt-1），最终导致PE 的发生、发展［9-10］。PE 目前尚无治愈方法，病情无法控制时只能终止妊娠，这也是该疾病早产率及胎新生儿死亡率高的原因之一。因此，为预测和预防先兆子痫发生尤为重要。
信号肽-CUB-表皮生长因子样结构域蛋白2（SCUBE2）是一种分泌型、膜相关的多结构域糖蛋白，该基因编码约1 000 个氨基酸的多肽分子，包括5 个可识别的基因序列：即1 个氨基末端的信号肽序列、9 个串联的EGF 样重复序列、一个间隔区、3 个富含半胱氨酸的残基及1 个羧基末端的CUB结构域［11］。SCUBE2 具有多种功能，如抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力、参与胚胎发育及调节软骨内骨形成及分化［12-14］。近年来研究发现，内皮细胞中的SCUBE2 可通过EGF 样重复序列和CUB 结构域结合VEGF 和VEGFR2 形成一个复合体，促进血管内皮细胞中VEGFR2 的磷酸化和下游信号转导，从而促进血管的生成［11］，该基因过表达可导致糖尿病血管并发症、动脉粥样硬化及肿瘤血管迁移［15-17］。血管内皮生长因子（VEGF）是一种多功能因子，在妊娠状态中，VEGF 被认为是由滋养细胞分泌的促血管生成因子，在诱导内皮细胞分裂、增殖、迁移，调控血管生成、滋养细胞增殖、浸润和分化、维持血管内皮功能方面均有重要作用［18］。VEGFR2 是VEGF 的受体之一，具有强大的络氨酸激酶活性，研究证明VEGF 与VEGFR-2 相结合对血管内皮健康非常重要［19］。刘蕾等［20］研究发现VEGFR2 表达于胎盘血管内皮细胞，并可能通过影响胎盘血管功能参与胎儿功能生长受限（fetal growth restriction，FGR）的发生发展。因此我们提出假设，SCUBE2 是否可能与VEGFR2 相互作用影响胎盘正常血管形成和发育参与子痫前期的发生、发展。
根据免疫组化结果显示SCUBE2 蛋白主要定位于胎盘合体滋养细胞及胎盘血管内皮细胞中，其在蛋白及mRNA 水平上均检测出SCUBE2、VEGFR2 表达水平在PE 组中低于对照组。同时，我们还观察到PE 组的胎盘病理切片中缺乏生理转化的厚肌壁官腔、纤维素样坏死、蜕膜血管动脉粥样硬化及胎盘绒毛合体结节形成并明显增多。因此，推测SCUBE2 蛋白可能与VEGFR2 蛋白具有相似功能及作用，影响胎盘血管内皮细胞的增殖与分化，影响正常胎盘血管形成和发育，SCUBE2 降低可能导致胎盘重铸不足。本研究结果中早发型PE 组SCUBE2、VEGFR2 在胎盘组织表达水平低于晚发型PE 组，这可能与PE 在不同发病阶段胎盘病变程度差异相关。ELISA 检测结果显示PE 组孕妇血清中SCUBE2 及VEGFR2 的表达水平低于对照组，其中早发型PE 血清SCUBE2、VEGFR2 表达水平低于晚发型PE 组，与胎盘组织中表达水平同步降低。此外，PE 组孕妇血清中SCUBE2 蛋白与VEGFR2 蛋白相关性分析显示，两者呈正相关。因此，推测胎盘中的SCUBE2 与VEGFR2 表达降低可能引起胎盘假性血管生成不完整，继而使胎盘缺血缺氧导致胎盘释放抗血管生成因子抑制血清中SCUBE2 及VEGFR2 表达，由此形成一个恶性循环，导致PE 疾病持续加重。此过程目前尚缺乏有效论证，还需进一步研究证实。
综上所述，PE 孕妇血清和胎盘中SCUBE2 和VEGFR2 表达量均降低，且血液中蛋白表达量相关性分析提示SCUBE2 与VEGFR2 之间为正相关。我们有理由怀疑在PE 疾病中，SCUBE2 在孕妇体内表达量降低可能参与了PE 的发生、发展，并可能与VEGFR2 共同作用调节胎盘血管内皮细胞增殖、分化。PE 病因及发病机制复杂，该实验仅浅层次提出了SCUBE2 可能影响胎盘血管侵袭和发育参与PE 的发展，其在PE 的胎盘血管上的作用机制尚待进一步研究。此外，免疫组化显示SCUBE2 还表达于胎盘合体滋养细胞中，SCUBE2是否还通过其他通路影响PE 的发生发展有待进一步研究。本实验样本含量少，且未对患病严重程度进行分析，后续将扩大样本量及更深层次探究该蛋白在PE 影响。
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