钱晓香，母 妮，杨六三，刘 航，陈 明，肖 春，董文霞
（云南农业大学 植物保护学院/云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201）
植物挥发物在植食性昆虫的寄主定向、产卵、聚集等行为中发挥着重要的作用。不少植物挥发物成分对植食性昆虫具有引诱作用，一些植物挥发物已经在田间试验中表现出对害虫较高的引诱活性［1］。但是由于植物挥发物具有较强的挥发性，持效期短，很难起到在较长时间内控制害虫的目的，因而其在田间的应用受到了较大的限制。因此，迫切需要研制出良好的植物挥发物缓释剂，控制植物挥发物的释放速率，延长持效期，提高植物挥发物对害虫的引诱效果。
一些研究发现，植物挥发物组分中d-柠檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯对一些害虫具有引诱活性。在室内行为测定中，将d-柠檬烯放入味源瓶中，能够引诱柑橘大实蝇(Bactrocera minax)的雄虫［2］；
将d-柠檬烯滴加在滤纸上，可以引诱花椒窄吉丁(Agrilus zanthoxylumi)的雄虫、朱红毛斑蛾(Phauda flammans)的雌雄成虫［3-4］；
将d-柠檬烯加入橡胶塞中，对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的雌虫具有引诱作用［5］。室内行为实验结果表明：将β-石竹烯滴加在滤纸上，能够引诱普通大蓟马(Megalurothrips usitatus)、斑翅果蝇(Drosophila suzukii)的雌虫、朱红毛斑蛾的雌雄成虫［4,6-7］；
将β-石竹烯放入味源瓶中，能够引诱橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)的雌虫［8］。此外，将β-石竹烯加入棉芯中，在田间可以显著引诱番石榴实蝇(Bactrocera correcta)的雄虫［9］；
将十四酸乙酯滴在棉花团上，在枣园中能诱集到大量的枣实蝇(Carpomya vesuv-iana)，在沙棘林里能诱集到沙棘绕实蝇(Rhagoletis batava)［10-11］。这些研究均限于室内行为测定或者田间初步实验，还没有真正将植物挥发物制成缓释剂应用于害虫的田间防治，主要由于这几种植物挥发物的挥发性太强，在滤纸片或者味源瓶中30 min之内就完全释放［12］。目前常用的缓释材料有橡胶塞、液体石蜡+离心管、聚乙烯小瓶、微胶囊、迷向丝、蜡滴等［13-15］。其中，橡胶塞是一种传统的缓释材料［16］，已经被广泛用于蛾类昆虫性信息素的研究，但其在自然条件下难以降解。大部分植物挥发物的分子量比信息素挥发物的更小，挥发性更强，橡胶塞是否适合作为植物挥发物的缓释材料应用于田间害虫防治，还不清楚。有研究将植物挥发物组分加到液体石蜡+离心管缓释材料中，制成诱剂用于害虫的田间引诱试验［15,17-18］。但是这些研究均未涉及植物挥发物成分在液体石蜡+离心管中的释放速率和持效期。2009年，Zada等［19］首次报道了一种新的缓释材料溶胶—凝胶的合成方法。2014年，Bian等［20］将该方法用于10种茶树挥发物组分（顺-3-己烯醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇、顺-3-己烯乙酸酯、反-2-己烯丁酸酯、己酸叶醇酯、苯甲醛、水杨酸甲酯、反-肉桂醛、反-2-己烯醛）缓释剂的制备，这些挥发物在溶胶—凝胶的持效期均长于14 d，其中顺-3-己烯醇、反-2-己烯醛、β-芳樟醇缓释剂对茶蚜(Toxoptera aurantii)具有良好的诱集效果，表现出了良好的应用前景。除了上述10种植物挥发物外，其他植物挥发物在溶胶—凝胶缓释剂中持效期的研究还未见报道。
为了明确适合应用于田间害虫防治的d-柠檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯缓释剂型，笔者比较了室外条件下这3种植物挥发物在橡胶塞、液体石蜡+离心管、溶胶—凝胶中的释放速率和持效期，从中筛选出了这3种挥发物的最适缓释剂，以期为其田间应用提供科学依据。
1.1 供试材料
供试标准化合物的信息见表1。
表1 供试标准化合物的纯度及来源
1.2 试验方法
1.2.1 不同溶剂中3种化合物含量测定的标准曲线绘制 正己烷溶剂中3种化合物含量-峰面积的标准曲线绘制：通过预实验确定3种化合物在橡胶塞中的残留量大概范围以及从液体石蜡+离心管中释放的大概剂量，将化合物的标准样品配制成1、10、50、200、500、1000 μg/mL共6个浓度梯度的正己烷溶液，利用气相色谱仪(Agilent Technologies，GC 7890 A)进行定量分析，其升温程序与Zhang等［21］的研究一致，进样量1 μL；
每个浓度重复3次，绘制化合物的含量-峰面积标准曲线方程（表2），用于测定挥发物在橡胶塞中残留量及从液体石蜡+离心管中的释放量。
表2 3种化合物含量-峰面积的标准曲线方程
甲醇溶剂中3种化合物含量-吸光率的标准曲线绘制：通过预实验确定3种化合物在溶胶—凝胶中残留量的大概范围，将化合物的标准样品配制成1、10、100、500、800、1000 μg/mL共6个浓度梯度的甲醇溶液，采用紫外分光光度计(GE/Biochrom 80-2112-21，Ultrospec 2100)先对3种化合物的吸收波长进行鉴定，再测定每种化合物对应6个浓度的吸光率，每个浓度3个样品，每个样品检测3次吸光率，最终建立3种化合物的含量-吸光率标准曲线方程（表3），用于3种挥发物在溶胶—凝胶中残留量的测定。
表3 3种化合物含量-吸光率的标准曲线方程
1.2.2 缓释剂型的制备 橡胶塞缓释剂型的制备：将d-柠檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯这3种化合物分别配制成浓度为20 mg/mL的正己烷溶液；
各取配制的正己烷溶液100 μL分别置于橡胶塞凹槽内，等待溶剂完全吸收后使用。
液体石蜡+离心管缓释剂型的制备：将d-柠檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯这3种化合物分别配制成浓度为4 mg/mL的液体石蜡溶液，取500μL置于1.5 mL离心管内，盖紧盖子，管盖上有1个直径为1.5 mm的圆孔。
溶胶—凝胶缓释剂型的制备：参照Zada等［19-20］的溶胶—凝胶合成方法，加入194 μL HCl（pH值为2）和776 μL蒸馏水，化合物用量为2 mg；
以不加化合物制作的溶胶—凝胶作为空白对照。
分别将制备的橡胶塞、离心管以及溶胶—凝胶柱(直径1.5 cm，高4.5 cm)放置在室外阳台，四面通风，每个处理之间间隔50 cm。
1.2.3 缓释速率的测定 在放置后第0、1、2、3、4、5、6、7、10、13、16、19、22、25、28天，收集残留的或者挥发到空气中的挥发物；
以溶剂刚好被橡胶塞完全吸收时视为第0天；
离心管挥发物的收集从挂在阳台1 d后开始；
以溶胶—凝胶缓释剂型制备完成时视为第0天。
橡胶塞缓释剂的缓释速率测定：采用有机溶剂浸提法。取下橡胶塞，用剪刀均匀剪成1～3 mm3的小方块，放到5 mL容量的玻璃离心管内，取2.0 mL正己烷溶液加入离心管，密封；
浸提24 h后，利用气相色谱仪进行检测，上样量为1 μL，重复检测3次，气相色谱程序同1.2.1节。根据测定所得的3种化合物的峰面积，利用标准曲线方程（表2）计算出化合物的残留量，并通过下列公式计算得出包埋率、残留率、释放速率：
包埋率(%)=第0天的残留量/挥发物理论含量×100%
残留率(%)=当天的残留量/挥发物理论含量×100%
前7 d的释放速率(%)=（前1 d的残留量-当天的残留量）/前1 d的残留量×100%
7 d后的释放速率(%)=（前3 d的残留量-当天的残留量）/3/前3 d的残留量×100%
溶胶—凝胶缓释剂的缓释速率测定：采用有机溶剂浸提法。将溶胶—凝胶捣碎，放入5 mL容量的玻璃离心管内，取2.0 mL甲醇溶液放入离心管，密封。参照Zada等［19］的方法进行提取，将上清液在7500 r/min下离心5 min，然后利用紫外分光光度计检测上清液的吸光率，以空白处理为对照，各重复测定3次；
将测定得到的吸光率减去空白对照的吸光率后，根据标准曲线方程（表3）计算出3种化合物的残留量，再利用上述公式计算包埋率、残留率、释放速率。
液体石蜡+离心管缓释剂的缓释速率测定：采用动态顶空吸附法。将离心管放在直径为1.5 cm、高为4.5 cm的玻璃管中，再将玻璃管放入250 mL清洁、干燥的玻璃提取瓶中。参照谢兴伟等［22］的方法进行提取，将大气采样仪改为真空泵（GAST Manufacturing Inc，DOA-P604-BN）。在收集时，真空泵气流量为200 mL/min，连续吸附12 h（9:00~21:00），保持环境通风、无异味。收集完成后，用1.5 mL正己烷将吸附柱吸附的物质洗脱至2 mL棕色样品瓶中，放入冰箱备用。将样品浓缩至20 μL，利用气相色谱仪进行检测，上样量1 μL，重复检测3次，气相色谱程序同1.2.1节。根据测定所得的3种化合物的峰面积，利用标准曲线方程（表2）计算其12 h的释放量，并计算平均释放速率。缓释剂中挥发性化合物的释放动力学规律符合一级动力学指数方程Ct=C0e-kt，其中Ct为缓释剂中挥发物在时间t时的剩余量，e为自然对数，C0为缓释剂中挥发物开始释放时的理论初始总量，k为常数［23-24］。通过该方程可将挥发物的平均释放速率转换为缓释材料中挥发物的残留量。参照边磊［25］的方法，将平均释放速率转化为Ct，相关计算公式为：
上式中：F(0, t)为时间t时挥发物的总释放量；
C0为整个释放期间缓释剂中挥发物的理论释放总量；
Ct为固定时间内缓释剂中挥发物的理论残留量；
a、b为常数。
根据上述公式计算缓释材料中挥发物的残留量，再计算出残留率和释放速率。
1.3 数据处理
采用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 21.0软件对试验数据进行统计分析，利用配对样本t检验比较化合物在橡胶塞、溶胶—凝胶两种缓释材料中包埋率的差异；
用Tukey法对3种化合物在不同缓释材料中的包埋率、缓释速率、最终残留率进行多重比较（α=0.05）。
2.1 3种化合物在不同缓释材料中的包埋率
从表4可以看出：d-柠檬烯、β-石竹烯在溶胶—凝胶中的包埋率极显著高于在橡胶塞中的，而十四酸乙酯在2种缓释材料中的包埋率差异不显著；
在橡胶塞中，十四酸乙酯的包埋率最高，d-柠檬烯的包埋率最低；
在溶胶—凝胶中，d-柠檬烯的包埋率最高，十四酸乙酯的包埋率最低。
表4 3种化合物在不同缓释材料中的包埋率 %
2.2 3种化合物在不同缓释材料中的时间-残留率关系
d-柠檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯在3种缓释材料中的残留率均随着时间的增加而下降；
除d-柠檬烯和β-石竹烯在橡胶塞中的时间-残留率关系呈指数趋势线外，其他3种化合物在不同缓释材料中的时间-残留率关系均呈线性趋势线。除了d-柠檬烯在橡胶塞中、β-石竹烯在液体石蜡+离心管中、d-柠檬烯和β-石竹烯在溶胶—凝胶中的时间-残留率公式的相关系数低于0.95外，其他校准公式的相关系数均大于0.95（表5）。
表5 3种化合物在不同缓释材料中时间-残留率的校准公式
2.3 3种化合物在不同缓释材料中的最终残留率
释放28 d后，在橡胶塞中，十四酸乙酯的最终残留率最高，d-柠檬烯和β-石竹烯的最终残留率均低于1%；
在液体石蜡+离心管中，β-石竹烯的最终残留率最高，d-柠檬烯的最终残留率最低；
在溶胶—凝胶中，β-石竹烯的最终残留率最高，d-柠檬烯和十四酸乙酯的残留率较低，均小于6%（表6）。
表6 3种化合物在不同缓释材料中的最终残留率 %
2.4 3种化合物在不同缓释材料中的释放速率
2.4.1 d-柠檬烯在不同缓释材料中的释放速率 由表7可知：第1天，橡胶塞和液体石蜡+离心管中d-柠檬烯的释放速率出现最大值，分别达189.32、249.35 μg/d；
第2天，溶胶—凝胶中d-柠檬烯的释放速率最大，达318.29 μg/d；
在橡胶塞中，d-柠檬烯前5 d的释放较快，释放量逐渐降低，直到第19天时释放速率为（0.00±0.02） μg/d，此时可以认为d-柠檬烯基本上不再释放；
在液体石蜡+离心管中，d-柠檬烯的释放速率由大变小，第28天的释放速率仍有31.66 μg/d；
在溶胶—凝胶中，d-柠檬烯前5 d的释放速率较大，之后释放缓慢，第28天的释放速率最小。
表7 3种缓释材料中d-柠檬烯的释放速率 μg/d
2.4.2β-石竹烯在不同缓释材料中的释放速率 如表8所示：第1天，溶胶—凝胶和橡胶塞中β-石竹烯的释放速率较大，显著高于在液体石蜡+离心管中的释放速率（6.90 μg/d）；
在橡胶塞中，β-石竹烯在前2 d快速释放，此后逐渐缓慢释放，第22天出现最小的释放速率（0.55 μg/d）；
在液体石蜡+离心管中，β-石竹烯在28 d内的释放速率均较低，释放速率在1.56~7.05 μg/d之间波动；
在溶胶—凝胶中，随着时间的延长β-石竹烯的释放速率逐渐变小。
表8 3种缓释材料中β-石竹烯的释放速率 μg/d
2.4.3 十四酸乙酯在不同缓释材料中的释放速率 从表9可以看出：第1天，溶胶—凝胶中十四酸乙酯的释放速率最大（197.04 μg/d），显著高于在橡胶塞和液体石蜡+离心管中的；
在橡胶塞中，十四酸乙酯随时间的延长而稳定释放，释放速率在14.81~82.72 μg/d之间波动；
在液体石蜡+离心管中，十四酸乙酯在28 d内的释放速率均较低，释放速率在2.54~7.94 μg/d之间波动；
在溶胶—凝胶中，十四酸乙酯的释放速率总体呈现从快到慢的趋势，在第2天的释放速率最大（262.22 μg/d），第13天的释放速率最小，仅8.40 μg/d。
表9 3种缓释材料中十四酸乙酯的释放速率 μg/d
笔者首次制备了d-柠檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯这3种植物挥发物的凝胶—溶胶缓释剂，并与橡胶塞、液体石蜡+离心管缓释剂进行了比较，结果表明：3种植物挥发物在液体石蜡+离心管和溶胶—凝胶中的持效期均大于或等于28 d，在橡胶塞中的持效期分别为d-柠檬烯19 d、β-石竹烯25 d、十四酸乙酯大于28 d。其中，包埋率高、释放速率稳定、持效期长的剂型有：橡胶塞中的十四酸乙酯，液体石蜡+离心管内3种化合物，溶胶—凝胶中的β-石竹烯。但是，液体石蜡+离心管中的十四酸乙酯和β-石竹烯的释放速率较低。
d-柠檬烯在橡胶塞中持效期最短，主要原因是包埋率太低（仅14.56%）和挥发太快。将d-柠檬烯溶液注入到橡胶塞凹槽后，由于其挥发性强，可被橡胶塞吸收的较少。有研究表明，在没有缓释载体的情况下，d-柠檬烯的释放速率高达260 μg/min［12］。在本研究中，被橡胶塞吸收的d-柠檬烯在前5 d便释放了94%，因此橡胶塞不适合作为d-柠檬烯的缓释材料。在液体石蜡+离心管和溶胶—凝胶中，d-柠檬烯的包埋率较高，持效期较长，释放也较稳定，这2种材料均适合作为d-柠檬烯的缓释材料。但是，与溶胶—凝胶相比，d-柠檬烯在液体石蜡+离心管中的最终残留率更高，释放速率也更稳定。因此，我们认为d-柠檬烯的最适缓释材料为液体石蜡+离心管。
β-石竹烯和d-柠檬烯均为萜烯类化合物，同样出现了在橡胶塞中包埋率较低（仅44.60%）和挥发性较强的情况，因此橡胶塞不合适作为β-石竹烯的缓释材料。β-石竹烯在液体石蜡+离心管中的释放速率太低，可能是由于受湿度影响过大。总之，液体石蜡+离心管也不适合作为β-石竹烯的缓释材料。本研究中的溶胶—凝胶材料由低于10%的硅氧化物和高于90%的空气构成，这种特殊的多空材质可以包埋更多的β-石竹烯，使其能保持更长的时间，且被包埋的β-石竹烯随着溶胶—凝胶材料的降解可以缓慢而稳定地释放，因此β-石竹烯的最适缓释材料为溶胶—凝胶；
另外，溶胶—凝胶的降解产物主要是水和二氧化硅，对环境友好和安全。
本研究结果表明，十四酸乙酯在橡胶塞中的包埋率较高（68.31%），并且释放速率较稳定。这可能是因为十四酸乙酯的分子量和功能团与一些蛾类昆虫性信息素组分十四醇乙酸酯的相同，橡胶塞一直是蛾类昆虫性信息素的最适缓释材料。因此，橡胶塞适合作为十四酸乙酯的缓释材料。十四酸乙酯在溶胶—凝胶中的包埋率虽然高（77.83%），但释放速率较橡胶塞而言更不稳定。因此，我们认为溶胶—凝胶不适合作为十四酸乙酯的缓释材料。
植物挥发物在缓释材料中的持效期和释放速率除受挥发物本身性质和缓释材料特性的影响外，还会受到温度、湿度、光照、风速等诸多外界因素的影响［26］。本研究将缓释剂放置在室外，处于变温条件下，白天（6：00~18：00）的气温为21.5~39.4 ℃，晚上（18：00~次日6：00）的气温为17.0~23.2 ℃，实验过程也受到了日照、降雨、刮风等因素的影响，这些因素对研究结果也有一定的影响。本研究初步筛选出了适合d-柠檬烯、β-石竹烯、十四酸乙酯田间应用的缓释材料，但其在田间的应用效果还需要通过田间害虫诱捕试验进行验证。
用于植物挥发物的良好缓释材料必须具有包埋率高、持效期长、释放缓慢而稳定的特点。本研究结果表明：十四酸乙酯的最适缓释材料是橡胶塞，d-柠檬烯的最适缓释材料是液体石蜡+离心管，β-石竹烯的最适缓释材料是溶胶—凝胶。
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