卫晨萱,许泓*
作者单位:200030 上海,1.上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院;2.上海市胚胎源性疾病重点实验室
女性子宫内膜是经历周期性脱落、修复、再生的高度动态变化组织。分泌期的子宫内膜通过一系列分子生物学与组织形态学转化,获得了接纳与孕育胚胎的能力,即子宫内膜容受性(endometrial receptivity)。这一短暂的时期主要在排卵后的第7～10天(即月经周期的第21～24天),也称为内膜的种植窗(window of implantation,WOI)。
成功的着床不仅需要优质胚胎,更需要处于WOI的高容受性子宫内膜作为孕育土壤,临床上因内膜容受性缺陷导致的着床失败是胚胎质量原因的两倍[1]。子宫内膜容受性下降会导致一系列与胚胎着床相关的生殖问题,如不孕、流产与子痫前期等[2]。因此,良好的子宫内膜容受性不仅可以提高胚胎着床率,还可预防后续相关的妊娠并发症。但至今尚未有公认的技术可以准确预测或调控子宫内膜的容受性[3],这也让改善子宫内膜容受性成为辅助生殖技术(assisted reproduction technology,ART)领域的难点之一。研究生理和病理状态下子宫内膜的功能,探索容受性建立的条件与机制,有助于建立相应的评估体系、突破ART的瓶颈,也是近年来的研究热点。
内膜上皮细胞是胚胎接触的第一个母体结构。分泌期内膜上皮细胞表面的特殊结构与相关黏附分子的表达,可以帮助胚胎选择适合的着床位点。此外,内膜上皮细胞仍需在一系列分子机制的调控之下,经历去增殖与去极性的转变,是胚胎进一步在基质内侵入种植的保障。
1.1 子宫内膜上皮细胞介导胚胎定植与黏附
在生理状态下,为保护子宫内膜免受细菌和蛋白酶的侵袭,子宫内膜上皮细胞子宫腔面附有丰富的糖萼,粘蛋白1(mucin1,MUC1)是其中的主要成分[4]。MUC1的表达在分泌期内膜表面不断增加[5],却在胚胎植入区域特异性下调[6]。上皮细胞产生的肿瘤坏死因子转换酶、膜型基质金属蛋白酶1(membrane type 1 matrix metalloprotease,MMP1)以及胚胎的相关分泌物质可能是MUC1在着床处下调的原因[5,7-8]。MUC1的特异下调,使局部上皮细胞表面的黏附因子得以暴露。黏附因子L-选择素与其配体分别在胚胎滋养层细胞与WOI内膜上皮细胞表面表达[9]。L-选择素介导的胚胎-内膜连接,可能是母胎连接的第一步。整合素也同样存在于内膜上皮细胞表面,在内膜处于分泌中期时,整合素可以与细胞外基质(extra-cellular matrix,ECM)相互作用,通过形成“整合素-ECM-整合素”或“ECM-整合素”的复合结构进一步巩固母胎连接[10]。
上皮细胞自身形态学变化也影响胚胎的定植与黏附。分泌期上皮细胞表面的微绒毛密度减低,并出现了细小水泡状突起的胞饮突结构[11]。胞饮突的表面几乎没有MUC1的附着[6],且与部分黏附因子的表达呈时空一致性[12]。胞饮突呈现的局部MUC1低表达、黏附因子高密度的特点,皆提示胚胎着床可能发生在胞饮突处。
已有临床研究报道了MUC1、整合素的异常表达与女性不孕症之间的相关性[13],但也有报道指出相关分子在不孕症女性内膜中的表达与健康对照组差异无统计学意义[14]。由此可见,亟需进一步研究探明内膜容受性改变发生过程中的具体分子机制。
1.2 子宫内膜上皮细胞的分化有利于胚胎进一步种植
胚胎完成与内膜上皮的黏附后,需要进一步向内膜深处浸润。在此期间,上皮细胞通过抑制增殖、去极性化的方式降低胚胎种植的难度。上皮细胞的增殖水平下降主要是孕激素作用的结果,通过上调Krüppel样转录因子15(Krüppel-like factor 15,KFL15),孕激素可以抑制雌激素对内膜上皮的增殖作用[15]。在此基础上,Monsivais D等[16-17]又进一步发现了可以激活KLF15的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)。BMP通过与上皮细胞表面受体结合活化下游SMAD信号,达到抑制上皮细胞增殖的作用。相关受体缺失的小鼠模型中都可观察到分泌期上皮细胞的过度增殖等不利于胚胎种植的改变。上皮细胞的去极性改变主要表现为细胞间连接的减少,作为内膜上皮细胞的主要细胞间连接复合体,E-钙粘蛋白(E-cadherin)/连环蛋白(catenin)的下调被认为是胚胎着床的必要条件。研究发现,同源盒蛋白(muscle segment homeobox,Msx)缺失的小鼠可以使上皮细胞E-cadherin持续表达,并导致胚胎着床失败[18]。在低表达Msx的人类内膜上皮细胞中也观察到同样的结果[19]。因此,Msx是上皮细胞去极性化的重要调控分子,通过抑制Wnt5a下调内膜上皮细胞的E-钙粘蛋白/连环蛋白复合体,帮助内膜上皮的容受性转化[18]。进一步研究发现,BMP与Msx不仅可以帮助内膜上皮细胞转变,而且还参与内膜基质细胞的蜕膜化。
在突破内膜上皮屏障后,胚胎逐渐侵入子宫内膜基质。多种信号分子参与基质蜕膜化的调控,形成蜕膜化的复杂信号网络,完成蜕膜化的基质是胚胎种植的先决条件,它不仅是胚胎着床与侵入的土壤,还为后续胎盘的形成与母胎免疫耐受的建立做好了准备。
2.1 子宫内膜基质细胞发生周期性的蜕膜反应
高水平孕激素与环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)是介导蜕膜反应的重要起始信号,并已成为体外诱导基质细胞蜕膜化的重要工具之一。孕激素受体的分子伴侣蛋白FK506结合蛋白52(FK506 binding protein 52,FKBP52)、核受体共激活因子2(steroid receptor coactivator-2,SRC-2)是起始信号转导的重要辅助因子[20-21]。在细胞与动物的蜕膜化模型研究中,已发现大量孕激素及cAMP相关的下游分子参与到基质细胞的蜕膜反应中,如BMP、同源框基因A10(homeobox A gene 10,HOXA10)、叉头状转录因子O1(forkhead box protein O1,FOXO1)、CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein,C/EBP)等。Pabona JM等[22]发现,在蜕膜反应发生前,高表达的上游KLF9抑制BMP2的激活,而随着蜕膜的开始,KLF9对BMP2的抑制作用减少,有利于蜕膜反应的发生。进一步的基因表达谱分析发现,BMP2的上调主要通过激活Wnt4-FOXO1及Msx1、2通路参与蜕膜反应。细胞水平抑制Wnt4、Msx1、Msx2,以及动物模型中特异性敲除子宫Msx都可导致相应的蜕膜化缺失与胚胎着床失败[23-24]。作为BMP2-Wnt4信号的下游效应分子之一,FOXO1在蜕膜化起始时大量入核,并可与HOXA10、C/EBP相互作用后与基因增强子结合,促进蜕膜化标志物泌乳素(prolactin,PRL)、胰岛素生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP1)的表达,加速蜕膜反应的进程[25-26]。在持续蜕膜化及妊娠状态时,FOXO1则会从胞核转至胞质。若此时孕激素突然撤退,胞质FOXO1则会再次大量入核,通过上调Bcl-2等促凋亡基因使蜕膜基质细胞凋亡。可见,FOXO1在蜕膜化的起始、维持过程中都有着不可或缺的作用[27]。除此之外,蜕膜化还需要表观遗传修饰的参与。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)、组蛋白甲基转移酶则可以通过修饰组蛋白改变基因表达水平,协同调控蜕膜反应[28-29]。微小RNA(microRNA)可以改变PRL、IGFBP1的表达水平,发挥相似的调控作用[30]。
在部分基质细胞完成蜕膜化后,这些细胞可以通过自分泌或旁分泌细胞因子如白细胞介素11(interleukin 11,IL-11)[31]、肝素结合性表皮生长因子(heparin binding epidermal growth factor,HB-EGF)、激活素[32],进一步加强蜕膜反应的进行。缺乏IL-11受体的小鼠基质蜕膜化无法进行:尽管胚胎可着床,但在妊娠早期就会发生流产[33]。而抑制HB-EGF信号则可下调PRL、IGFBP1等蜕膜分子标志表达,并会增强细胞内的促炎通路,诱导基质细胞凋亡[34]。基质细胞间的缝隙连接的存在,可能为细胞间传递蜕膜相关信息与细胞间通讯提供了结构基础[35]。除基质细胞自身的调节作用外,上皮细胞与胚胎滋养层细胞也可分泌白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)等,进一步诱导基质细胞蜕膜化[36-37]。
2.2 蜕膜化的基质细胞是胚胎种植与进一步生长发育的基础
在特定的子宫内膜微环境中,蜕膜为胚胎的种植、后续的胎盘形成、胎儿生长发育提供了充足的支持。在胚胎侵入的过程中,蜕膜基质细胞分泌作用于胚胎滋养层细胞的细胞因子具有双重作用。蜕膜基质细胞可以产生丰富的基质金属蛋白酶,帮助胚胎在基质内侵入种植[38]。而与胚胎接触的蜕膜细胞并未出现退化或凋亡的表现,表明胚胎的侵入与种植是受到基质细胞的严格调控,可对母体起到一定的保护作用[39]。基质细胞分泌的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可能参与子宫螺旋动脉的成熟,有利于后续胎盘形成与胎儿养分的供给[40]。良好的蜕膜基质细胞可能还具有识别胚胎质量的能力,在体外共培养模型中,与不良胚胎共培养的基质细胞分泌因子发生改变,主要表现为HB-EGF、ILs等分泌下降,不利于胚胎着床[41]。
同时,在蜕膜化的过程中,蜕膜基质细胞还可以介导免疫细胞在蜕膜中的浸润,诱导并建立母胎免疫耐受。在调控固有免疫方面,蜕膜基质细胞可以通过分泌白细胞介素15(interleukin-15,IL-15)、吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)等细胞因子,招募低细胞毒性的自然杀伤细胞、抑制树突细胞的分化与抗原提呈,从而抑制相关炎症反应的发生[42]。而在调控适应性免疫应答方面,蜕膜基质细胞首先可以通过在细胞表面高表达半乳糖凝集素(galectin-1),抑制T细胞的增殖活化[43]。同时,蜕膜基质细胞分泌的相关T细胞趋化因子CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10,CXCL10)、CXC趋化因子配体15(CXC chemokine ligand 15,CXCL15)水平相对较低,对招募T细胞到内膜定植的能力相对较弱[44]。因此,蜕膜基质细胞通过招募低毒性的免疫细胞、抑制高毒性的免疫细胞活化的方式,逐渐建立蜕膜中的母胎免疫耐受屏障。
子宫内膜存在一定数量的免疫细胞,和外周循环中存在的免疫细胞有着较大的表型和功能差距。在内膜上皮及基质细胞帮助胚胎着床的基础上,同种异体的胎儿能够安然存在于母体中,与内膜免疫细胞的存在息息相关。它们可以参与调控内膜容受性、诱导免疫耐受,与内膜上皮及基质细胞共同促进胚胎着床及胎儿发育。
3.1 自然杀伤细胞
子宫自然杀伤(uterine natural killer,uNK)细胞在分泌期大量增殖分化,是蜕膜含量最丰富的免疫细胞。高表达CD56的uNK细胞毒性低,主要通过分泌细胞因子、与胎儿细胞表面配体的相互作用发挥生物学作用。在妊娠状态下,uNK细胞作为蜕膜免疫细胞的主要成分,在妊娠早期主要分布于胎儿绒毛外滋养层细胞(extravillous trophoblast,EVT)和子宫螺旋动脉周围,通过分泌血管生成素(angiogenin,ANG)、γ-干扰素(interferon-γ)、血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)等细胞因子,诱导并破坏子宫血管平滑肌细胞的完整性,促进螺旋动脉的重构[45]。缺乏uNK细胞的大鼠胎盘呈低氧环境,EVT呈现更强的侵袭力,提示uNK可以通过调控血管重构,间接调控EVT入侵内膜的能力[46]。
作为与母体直接接触的EVT,其表面的多种组织相容性复合体Ⅰ类抗原(major histocompatibility complexes-I,MHC-I),可以被uNK细胞表面的受体识别。其中,EVT表面的人类白细胞抗原-C(human leucocyte antigen class C,HLA-C)与uNK细胞表面的自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer-cell immunoglobulin-like receptor,KIR)的相互作用被认为是胎儿发育、胎盘形成的重要因素之一。特定的HLA-C和KIR组合,如高表达HLA-C2的胎儿和仅表达抑制性KIR的母体,更容易导致复发性流产和胎儿生长受限等不良妊娠结局[47-48]。Alecsendru D等[49]发现,根据女性患者的KIR选择合适的HLA-C精子供体,可以减少不良妊娠结局。这不仅提示了uNK和EVT的相互作用在胚胎发育中的重要地位,也为未来的辅助生殖治疗提供了一定的参考价值。
3.2 巨噬细胞
巨噬细胞是子宫内膜和蜕膜中仅次于uNK细胞的免疫细胞。外周血循环中的单核细胞可被招募到子宫内膜组织分化成为蜕膜巨噬细胞[50],并受卵巢甾体激素、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)、白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)等调控。Gnainsky Y等[51]发现,内膜活检操作所引起的局部炎症反应伴有巨噬细胞的浸润提高了胚胎着床率,提示蜕膜巨噬细胞有利于内膜容受性的建立与胚胎着床的发生。同时,蜕膜的巨噬细胞还可以调控内膜上皮细胞中与胚胎黏附相关的基因表达,为巨噬细胞参与内膜容受性调控提供了更多的支持[52]。
与uNK细胞类似,蜕膜巨噬细胞分布在滋养层细胞与螺旋动脉周围,参与螺旋动脉重塑与滋养层细胞浸润。妊娠时期,蜕膜巨噬细胞以抗炎的M2亚群为主,主要分泌抗炎、免疫调节、组织重塑相关细胞因子[53]。除此之外,蜕膜巨噬细胞仍保留吞噬作用,清除妊娠过程中不断凋亡的细胞,防止其凋亡小体的释放诱导蜕膜炎症反应[54]。而清除凋亡细胞的过程也可以进一步促进巨噬细胞分泌免疫抑制因子,进一步巩固妊娠过程中的免疫抑制环境[55]。
然而有部分学者认为,巨噬细胞的亚群和相对应的生物学功能是复杂多样的,该细胞会根据所处的微环境变化进行表型的改变。已有研究发现,在蜕膜组织中存在特殊类型巨噬细胞可以同时分泌促炎、抗炎细胞因子,无法以既定标准将其归类[56]。在子宫内膜中,可能仍存在没有发现的巨噬细胞亚群。进一步探索蜕膜巨噬细胞的亚群,可以为探索巨噬细胞在子宫内膜容受性与胚胎发育的功能中提供新的思路。
3.3 树突细胞
树突细胞(dendritic cell,DC)是重要的抗原提呈细胞,对容受性内膜的建立有着重要的作用。不同于在妊娠早期进一步被招募、增殖的巨噬细胞和NK细胞,DC的数量在妊娠后进一步减少[57],可能是机体为了抑制抗原提呈、防止T细胞激活的结果。同时,蜕膜中的淋巴管密度相对较低[58],DC难以从组织迁移到淋巴结[59],进一步减少了DC与T细胞相互作用的可能。Bartmann C等[60]发现,蜕膜中的DC以未成熟DC(immature dendritic cell,iDC)为主。因此,即便有DC成功迁移,这些iDC表面表达的分子与分泌的细胞因子也主要发挥着抑制T细胞免疫应答的作用[61],进一步建立妊娠早期的母胎免疫耐受。然而,蜕膜DC的作用主要在动物模型上被探究,人类蜕膜DC的作用尚未得到证实。
3.4 T细胞
已有临床研究结果显示,调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的存在可以减少不良妊娠结局的发生[62]。如上文所述,蜕膜基质细胞对于T细胞的活化具有抑制作用。而胎儿的抗原、蜕膜固有免疫细胞分泌的细胞因子也都可以刺激Treg亚群的增殖分化[63-64]。这种胎儿特异性的Treg甚至还具有记忆性,在再次妊娠后可以快速扩增,不断起到母胎免疫豁免的作用[65]。
目前,对蜕膜T细胞的认知仍停留在它们发挥的免疫应答效果,尚未有文献报道T细胞对支持胚胎生成、胎盘形成的功能。尽管Treg的存在是介导妊娠免疫耐受的基础,但在蜕膜中仍有其他T细胞亚群。妊娠期间,这些促炎的T细胞可能在母体抵抗病原体感染中发挥作用[66],其具体机制尚未明确。
子宫内膜作为胚胎接触母体的第一道屏障,在胚胎着床的过程中起着至关重要的作用。高容受性内膜主要由去极性的上皮细胞、蜕膜化的基质细胞与蜕膜免疫细胞组成,它们在可容受胚胎的内膜中扮演着不同的角色。内膜上皮细胞表面的胞饮突与相关黏附因子的表达促进胚胎的定植与黏附,使胚胎能够稳定在内膜表面。去极性的上皮细胞可帮助胚胎进一步侵入内膜基质,充分蜕膜化的基质细胞可以分泌相关细胞因子,参与胚胎滋养层细胞的侵入与蜕膜免疫细胞的招募。而免疫细胞在蜕膜的浸润,既建立了母胎免疫耐受屏障,也参与了蜕膜血管的重塑与母胎界面的建立。这些细胞在容受期的组织形态学与分子生物学转变,是内膜容受性建立的基础与胚胎着床的前提。我们认识到,内膜容受微环境的建立是子宫内膜细胞同步交互的结果。在聚焦某一细胞功能机制的同时,也需考虑到周围微环境对其的影响。内膜容受性的建立对后续胎盘形成、胚胎生长发育也有着重要的作用。因此,在关注WOI时期内膜容受性作用的同时,也应注意到其远期效应。
子宫内膜容受性相关研究也存在一些挑战和机遇。在细胞实验中,因为技术和伦理的问题,优质的原代胚胎及胚胎滋养层细胞较难获得;而在动物实验中,由于模式动物的妊娠过程相较于人类仍有差异,对内膜容受性的机制仍存在认知偏差与不足。更优化的模型建立,如类器官三维培养等,可能是未来内膜容受性基础研究的重点之一。从临床研究的角度而言,子宫内膜容受性评估、治疗与预防仍是经久不衰的主题。已有ERA test(endometrial receptivity array)和Win-Test(window implantation test)[67-68]两种子宫内膜容受性评估工具投入临床使用,为个性化的冷冻胚胎移植(frozen embryo transfer,FET)的时间选择提供了参考标准。也有学者基于前期研究基础,尝试为不孕患者提供外源性LIF以期提高内膜容受性[69]。建立“临床-基础-临床”的高效转化机制,有利于进一步理解子宫内膜容受性的建立,更有助于完善子宫内膜容受性的评估、治疗及预防体系。
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