孙丽坤，赵凤依，常玮鑫，杜 玄，李 华
（张家口市第二医院a.神经内科；
b.检验科，河北张家口 075000）
脑卒中是一种严重威胁人类生命与健康的疾病，急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke)是一种常见的脑卒中类型[1]，在我国的脑血管病患者中大约80%为缺血性脑卒中，缺血性脑卒中具有极高的致残率、病死率和复发率，严重影响着患者的身心健康[2]。长链非编码核糖核酸（long noncoding RNA，lncRNA）在表观遗传及转录水平调控其它基因的表达。lncRNA性别决定相关基因簇2重叠转录本（sex determination related gene cluster 2 overlapping transcript，SOX2OT）可通过表观遗传及转录，转录后等多个层次参与到基因表达的调控，并发挥相应的生物学功能[3]。随着学者的不断研究，发现lncRNA SOX2OT在一些肿瘤等疾病的发生过程中具有过表达以及表达抑制的趋势[4-5]。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一类非编码小分子RNA。相关研究证明，miR-331对人类多种疾病具有抑制作用[6-7]，也有研究表明miR-331可在神经系统中特异性表达，表明它是细胞分化或炎症发生过程中的重要调节因子[8]。但当前鲜有文献探究lncRNA SOX2OT和miR-331在急性缺血性脑卒中患者中的变化情况，基于此本研究主要探究急性缺血性脑卒中患者血清lncRNA SOX2OT和miR-331水平与颈动脉斑块稳定性和神经功能缺损的关系，以期为急性缺血性脑卒中的防治提供理论参考。
1.1 研究对象 选取2020年3月～2021年11月张家口市第二医院神经内科收治的120例急性缺血性脑卒中患者为研究组，其中男性69例，女性51例，年龄50～80（59.23±6.18）岁。另外选取同时期在医院健康体检人员120例作为对照组，其中男性58例，女性62例，年龄49～78（57.69±6.64）岁。两组研究对象的性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入标准：①所有患者均经头颅CT，MRI明确诊断，同时均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[9]中关于急性缺血性脑卒中的诊断标准；
②患者均为首次确诊且病情稳定；
③临床资料完整。排除标准：①无症状性脑梗死；
②并发心、肝、脾等严重器质性疾病患者；
③并发恶性肿瘤、感染性疾病或血液系统疾病患者；
④颅内肿瘤或感染以及外伤引起的脑卒中。本研究已通过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。
1.2 仪器与试剂 彩色多普勒超声诊断仪（型号GE 730，美国GE公司）；
荧光定量PCR仪（型号X960，上海力康生物医疗科技控股有限公司）；
RNA提取试剂盒（批号JL30572），反转录试剂盒（批号JL42781），PCR检测试剂盒（批号JL10593），均为北京中生柏奥生物科技有限公司产品。
1.3 方法
1.3.1 颈动脉超声检查：患者入院时，采用彩色多普勒超声诊断仪对患者双侧颈总动脉以及分叉处、颈内、颈外动脉的内膜中层厚度（intima-media thickness，IMT）进行测量。评价标准[10]：①斑块：IMT≥1.5 mm；
②内膜增厚：1.0 mm≤IMT＜1.5 mm；
③正常：IMT＜1.0 mm。根据急性缺血性脑卒中患者的颈动脉斑块所处位置、形态以及大小、回声特点[10]，将其分为三组：无斑块组24例（内膜增厚或者正常）、稳定斑块组40例（斑块周边及内部呈稀疏点状增强或无增强）和不稳定斑块组56例（斑块由周边向内部呈密度较高的点状及短线状增强）。
1.3.2 神经功能缺损评价：依据患者入院时美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评分将急性缺血性脑卒中患者分为三组[11]，轻度神经功能缺损组51例（NIHSS评分≤4分）、中度神经功能缺损组47例（4分＜NIHSS评分≤20分）和重度神经功能缺损组22例（NIHSS评分＞20分）。
1.3.3 实时荧光定量PCR法检测血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平：采集急性缺血性脑卒中患者入院后次日清晨、健康体检人员体检当日清晨空腹外周血5 ml，3 500 r/min离心10 min，收集上层血清保存于-20℃冰箱中待测。按照RNA提取试剂盒和反转录试剂盒说明书对血清进行RNA提取，并反转录为cDNA。根据PCR检测试剂盒说明书配置实验反应体系，设定反应条件：94℃预变性15 min；
94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。lncRNA SOX2OT以GAPDH为内参，miR-331以 U6为内参，采用 2-∆∆Ct计算法对血清中lncRNA SOX2OT和miR-331表达水平进行相对定量分析。lncRNA SOX2OT，miR-331，GAPDH和U6引物序列见表1。
表1 引物序列
1.4 统计学分析 利用SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析，计量资料经检验均符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，采用t检验进行两组间差异比较，采用单因素方差分析进行多组间差异比较，组间进一步两两比较采用SNK-q检验；
计数资料以例数（n）表示，采用卡方检验进行组间差异比较；
Pearson法分析急性缺血性脑卒中患者血清lncRNA SOX2OT和miR-331水平相关性；
受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析血清lncRNA SOX2OT和miR-331水平对急性缺血性脑卒中患者不稳定斑块形成和重度神经功能缺损的诊断价值，曲线下面积（area under curve，AUC）比较采用Z检验；
P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.1 研究组与对照组血清lncRNA SOX2OT和miR-331水平比较 与对照组比较，研究组血清lncRNA SOX2OT水平明显升高（1.86±0.47 vs 1.00±0.03），miR-331水平明显降低（0.51±0.14 vs 1.02±0.04），差异有统计学意义（t=20.004,38.370，均P＜0.001）。
2.2 无斑块组、稳定斑块组、不稳定斑块组血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平比较 无斑块组、稳定斑块组和不稳定斑块组血清lncRNA SOX2OT水平依次升高（1.27±0.31，1.78±0.45，2.18±0.56），miR-331水平依次降低（0.74±0.19，0.56±0.16，0.37±0.10），差异均有统计学意义（F=30.671,60.653，均P＜0.05）。稳定斑块组、不稳定斑块组与无斑块组比较，差异均有统计学意义（t=4.892，4.059；
7.468，11.400，均P<0.05）；
稳定斑块组与不稳定斑块组比较，差异均有统计学意义（t=3.736，7.151，均P<0.05）。
2.3 轻度神经功能缺损组、中度神经功能缺损组、重度神经功能缺损组血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平比较 轻度神经功能缺损组、中度神经功能缺损组和重度神经功能缺损组血清lncRNA SOX2OT水平依次升高（1.58±0.41，1.94±0.48，2.35±0.60），miR-331水平依次降低（0.67±0.18，0.46±0.12，0.27±0.07），差异均有统计学意义（F=21.100, 65.923，均P＜0.001）。轻度神经功能缺损组与中度神经功能缺损组、重度神经功能缺损组比较，差异均有统计学意义（t=4.002，6.736；
6.366，10.067，均P<0.05），中度神经功能缺损组与重度神经功能缺损组比较，差异均有统计学意义（t=3.049，6.882，均P<0.05）。
2.4 急性缺血性脑卒中患者血清lncRNA SOX2OT和miR-331水平的相关性分析 见图1。急性缺血性脑卒中患者血清lncRNA SOX2OT与miR-331水平呈负相关（r=-0.467，P＜0.001）。
图1 急性缺血性脑卒中患者血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平的相关性分析
2.5 血清lncRNA SOX2OT和miR-331水平对急性缺血性脑卒中患者不稳定斑块形成的诊断价值 见表2和图2。ROC曲线分析显示，血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平诊断急性缺血性脑卒中患者不稳定斑块形成的AUC分别为0.819，0.766，二者联合AUC为0.921；
二者联合优于血清lncRNA SOX2OT，miR-331单 独诊断（Z=2.211，3.179，P=0.027，0.001）。
表2 血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平对急性缺血性脑卒中患者不稳定斑块形成的诊断价值
图2 血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平诊断急性缺血性脑卒中患者不稳定斑块形成的ROC曲线
2.6 血清lncRNA SOX2OT和miR-331水平对急性缺血性脑卒中患者重度神经功能缺损的诊断价值 见表3和图3。ROC曲线分析显示，血清lncRNA SOX2OT和miR-331水平诊断急性缺血性脑卒中患者重度神经功能缺损的AUC分别为0.716，0.801，二者联合AUC为0.904；
二者联合优于血清lncRNA SOX2OT，miR-331单独诊断（Z=2.673，2.081，P=0.008，0.037）。
图3 血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平诊断急性缺血性脑卒中患者重度神经功能缺损的ROC曲线
表3 血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平对急性缺血性脑卒中患者重度神经功能缺损的诊断价值
急性缺血性脑卒中是临床上常见的神经系统急症，已成为导致我国居民致死率、致残率不断升高的一个最重要的中枢神经系统血管事件，是当今医学界所面临的难题之一[12]。急性缺血性脑卒中后可能出现不稳定斑块形成及不同程度的神经功能缺损，不利于患者预后。因此，寻找能早期明确诊断不稳定斑块形成和重度神经功能缺损的指标，对患者治疗及预后恢复显得尤为重要。
有研究发现lncRNA在缺血性脑卒中的生理病理过程中扮演着重要的调控角色[13]。其中lncRNA SOX2OT基因定位于3号染色体3q26.3，它的确切功能目前还没有很明确的定义，但是最近的研究发现其在一些生理病理过程中发挥着相关的调控功能[14]。有研究发现lncRNA SOX2OT在心肌病中对线粒体具有密切相关的调控作用[15]。且WANG等[16]研究报道，肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞中lncRNA SOX2OT表达增加与脑缺血再灌注损伤的发生有关。本研究发现，与健康体检者比较，急性缺血性脑卒中患者血清lncRNA SOX2OT水平明显偏高，与WANG等[16]研究类似；
同时本研究分析了血清lncRNA SOX2OT与颈动脉斑块稳定性和神经功能缺损的关系，发现无斑块组、稳定斑块组、不稳定斑块组血清lncRNA SOX2OT水平依次升高，轻度神经功能缺损组、中度神经功能缺损组和重度神经功能缺损组血清lncRNA SOX2OT水平依次升高。以上结果证明血清lncRNA SOX2OT水平与急性缺血性脑卒中患者的病情状况具有密切相关性，可能参与调控着病情的发生发展进程。
miRNAs是内源性的非编码调节RNA，其可以调节细胞的生长、增殖、分化、凋亡等生物学过程，越来越多的研究证明miRNA参与了人类疾病的发展，并有研究发现其与缺血性脑血管病的发生、发展具有密切关系[17-18]，缺血性脑损伤会导致患者体内的miRNA表达发生显著变化[19]。梁卫勤等[20]的研究发现miR-331在对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭能力具有相关的调控作用，可通过上调miR-331水平增加鼻咽癌细胞的辐射敏感性。近年研究显示，癫痫前脑的细胞外囊泡中miR-331-3p表达下调，参与慢性癫痫的病理生理过程[21]。本研究结果显示，急性缺血性脑卒中患者血清miR-331水平低于健康体检者，并且无斑块组、稳定斑块组、不稳定斑块组血清miR-331水平依次降低，轻度神经功能缺损组、中度神经功能缺损组、重度神经功能缺损组血清miR-331水平依次降低，提示血清miR-331水平降低参与急性缺血性脑卒中发病、颈动脉斑块稳定性及神经功能缺损程度。
相关研究报道[16]，miR-135a-5p下调和核受体亚家族3组C成员2（nuclear receptor subfamily 3 group C member 2，NR3C2）上调，均可逆转lncRNA SOX2OT敲低对PC12细胞氧化应激、细胞凋亡和炎症的抑制作用，且lncRNA SOX2OT低表达可通过调节miR-135a-5p/NR3C2轴减轻脑缺血再灌注损伤。另有研究显示[22]，lncRNA GAPLINC可通过对miR-331-3p的负调节抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进了细胞凋亡，可作为胶质母细胞瘤新的治疗靶点。此外，lncRNA SOX2OT可通过调节miR-331-3p/神经源性分化因子1（neurogenic differentiation factor 1，NeuroD1） 轴促进脊髓损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤[4]。以上既往研究结果说明，lncRNA和miRNAs通过正调节和负调节在各种疾病中发挥作用。本研究通过绘制散点图，发现急性缺血性脑卒中患者血清lncRNA SOX2OT与miR-331水平呈负相关，提示lncRNA SOX2OT与miR-331可能通过某种机制相互作用参与急性缺血性脑卒中发病。古春青等[23]研究报道，溶栓前NIHSS评分对急性缺血性脑卒中患者静脉溶栓后早期神经功能恶化具有较高的预测价值，但由于该量表项目多且繁琐，反应迟钝的老年人及昏迷患者应用该量表进行评价，可能得到的NIHSS评分存在误差。因此，本研究选用易获取且稳定的血清指标（lncRNA SOX2OT，miR-331）诊断急性缺血性脑卒中患者不稳定斑块形成及重度神经功能缺损，结果发现血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平联合诊断不稳定斑块形成及重度神经功能缺损的AUC明显高于二者单独诊断，提示临床联合检测血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平，可能对评估急性缺血性脑卒中患者不稳定斑块形成及重度神经功能缺损具有重要的价值。尤其是对于老年和昏迷的急性缺血性脑卒中患者，血清lncRNA SOX2OT，miR-331水平联合检测可能具有积极意义。
综上所述，急性缺血性脑卒中患者血清lncRNA SOX2OT水平呈高表达，miR-331水平呈低表达，二者与颈动脉斑块稳定性和神经功能缺损程度有一定关系，联合检测二者水平有利于评估患者不稳定斑块形成及重度神经功能缺损。由本试验结果推测lncRNA SOX2OT，miR-331两者可能存在着某种调控关系，影响着急性缺血性脑卒中的发生和发展以及病情的严重程度，但是其中的相关机制尚需深入研究。
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