李煦照，李红美，张帅男
（贵州中医药大学药学院 贵阳 550025）
骨关节炎是一种慢性退行性关节疾病。其全球发病率为2%-6%，70岁以上的人群发病率超过40%[1]。关节滑膜损伤是骨关节炎的重要病理特征之一，涉及了多种病理机制，如炎症、血小板的聚集、细胞凋亡、生长因子失调，蛋白质合成功能障碍等[1-3]。滑膜炎症影响了骨关节炎的症状和发病进程[4]。此外，血小板聚集是该疾病滑膜中的重要炎症标志物[5]。多种生长因子从血小板中释放出来，并参与了病变组织的修复和再生[3]。在骨关节炎中，细胞凋亡和蛋白质的合成过程也参与了滑膜组织的修复和再生[3,6]。
追风伞是报春花科植物狭叶落地梅Lysimachia paridiformisFranch. var.stenophyllaFranch 的干燥全草，具有祛风通络、活血止痛的功效，可以用于风湿痹痛、四肢拘挛、半身不遂等[7]。前期生物标签研究表明[2-3]，追风伞影响了关节滑膜中一些与炎症、细胞凋亡、血小板聚集和蛋白质合成过程相关的内源性靶点的表达。这些靶点参与了骨关节炎的发病机制[2-3]。因此，我们推测，追风伞可以通过调节这些病理过程来减轻骨关节炎的滑膜损伤。
1.1 追风伞提取物的制备
追风伞提取物的制备方法已在本课题组的前期研究中进行描述[3]。追风伞饮片粉碎后使用10倍量的蒸馏水进行回流提取，总共提取3次，每次2 h，合并提取液，进行冻干，得到冻干粉，得率为12.65%。
1.2 试剂
碘乙酸钠（I2512，美国Sigma-Aldrich公司）；
双氯芬酸钠（D6899，美国Sigma-Aldrich公司）；
前列腺素E1（PGE1）酶联免疫吸附分析试剂盒（E-EL-0052c，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；
花生四烯酸（AA）酶联免疫吸附分析试剂盒（E-EL-0051c，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；
整合素α2b抗体（Itga2b，PB9647，武汉博士德生物工程有限公司）；
整合素β抗体（Itgb3，BM4120，武汉博士德生物工程有限公司）；
血管内皮生长因子A抗体（VEGFA，BA0407，武汉博士德生物工程有限公司）；
胰岛素样生长因子1抗体（IGF 1，BA0939，武汉博士德生物工程有限公司）；
成纤维细胞生长因子2抗体（FGF-2，PB0619，武汉博士德生物工程有限公司）；
肝细胞生长因子抗体（HGF，BA0911，武汉博士德生物工程有限公司）；
肿瘤坏死因子α抗体（TNF-α，PB0082，武汉博士德生物工程有限公司）；
血小板衍生生长因子A抗体（PDGF-A，bs-0196R，北京博奥森生物技术有限公司）；
转化生长因子β1抗体（TGFβ1，bs-0086R，北京博奥森生物技术有限公司）；
延伸因子1-α2抗体（eEF1A2，bs-13054R，北京博奥森生物技术有限公司）；
翻译起始因子2B亚基β抗体（EIF2B2，bs-14536R，北京博奥森生物技术有限公司）；
真核翻译起始因子4B抗体（EIF4B，bs-4103R，北京博奥森生物技术有限公司）；
丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 56 kDa调节亚基抗体（PPP2R5C，bs-11991R，北京博奥森生物技术有限公司）；
脆性X智力低下综合征相关蛋白1抗体（FXR1，bs-5528R，北京博奥森生物技术有限公司）。
1.3 仪器
数字游标卡尺（德国Preisser公司）；
RM2235石蜡切片机（德国LEICA公司）；
DM3000显微镜（德国LEICA公司）。
1.4 动物与分组
60只雄性Sprague-Dawley大鼠，清洁级，体质量250 ± 20 g，购自中国医学科学院放射医学研究所，许可证号：SCXK（津）2014-0002。大鼠饲养于中国医学科学院放射医学研究所，12 h光照、12 h避光循环饲养，室内温度为（22 ± 1）℃，相对湿度40%-50%，饲喂标准饲料和饮用水。
将大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药治疗组、追风伞低剂量组、追风伞中剂量组、追风伞高剂量组，每组10只。模型组、阳性药治疗组和追风伞治疗组麻醉后，使用26G针头将50 μL的碘乙酸钠（3 mg）生理盐水溶液通过髌韧带注入膝关节中[3]。空白组注射0.9%无菌生理盐水。造模24 h后，追风伞低剂量组、追风伞中剂量组、追风伞高剂量组分别灌胃给予相当于人生药量0.143、0.288、0.428 g·kg-1的追风伞提物，每天1次，连续30天。阳性药治疗组给予10 mg·kg-1的双氯芬酸钠，每天1次，连续30天。空白组和模型组给予等量生理盐水，每天1次，连续30天。
1.5 关节肿胀度分析和样本收集
最后一次给药24 h后，用数字游标卡尺测量大鼠关节的直径。随后，收集各组大鼠关节滑膜组织样本，用于组织病理学、免疫组化、酶联免疫吸附分析和Western blot分析。
1.6 组织病理学和免疫组学分析
将关节滑膜组织样本置于4%的多聚甲醛中固定过夜，随后包埋在石蜡中，用石蜡切片机切成5 mm的石蜡切片。一部分组织切片使用苏木精和伊红染色进行组织病理学分析；
另一部分组织切片根据Elivsion二步法进行免疫组化染色，用于分析Itga2b（抗体稀释比例1∶100）、Itgb3（抗体稀释比例1∶100）、eEF1A2（抗体稀释比例1∶400）、EIF2B2（抗体稀释比例1∶400）和EIF4B（抗体稀释比例1∶400）的表达。在200倍显微镜视野下进行图像采集，随后运用Image Pro Plus软件（6.0版本，美国Media Control Netics公司）来计算靶蛋白的积分光密度（IOD）。
1.7 酶联免疫吸附分析
将关节滑膜组织样本置于冰冷的PBS中进行匀浆，将匀浆液在4℃下，2500 r·min-1离心10 min，取出上清液置于离心管中。随后根据说明书操作，使用酶联免疫吸附试剂盒分析组织匀浆中的AA和PGE1的水平。
1.8 Western blot分析
运用Western blot分析关节滑膜组织中的PDGFA（抗体稀释比例1∶500）、VEGFA（抗体稀释比例1∶500）、IGF 1（抗体稀释比例1∶200）、FGF-2（抗体稀释比例 1∶100）、HGF（抗体稀释比例1∶300）、TGFβ1（抗体稀释比例1∶500）、PPP2R5C（抗体稀释比例1∶600）、FXR1（抗体稀释比例1∶500）和TNF-α（抗体稀释比例1∶500）的表达量，步骤已在本课题组的前期研究中进行描述[3]。
图1 关节肿胀度分析（A）及AA（B）和PGE1（C）的酶联免疫吸附分析（n=10）
图2 大鼠关节滑膜的组织病理学分析（n=10，200×）。
1.9 统计学分析
2.1 关节肿胀度分析
与空白组相比（如图1A），模型组大鼠关节直径显著增加（P＜0.05）。与模型组相比，阳性药治疗组和追风伞治疗组的大鼠关节直径显著减小（P＜0.05）。中、高剂量组之间存在显著性差异。
图3 大鼠关节滑膜组织中Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表达水平（n=10，200×）
2.2 关节滑膜组织中的AA和PGE1的水平
与空白组相比（如图1B和C），模型组关节滑膜组织中的AA和PGE1的水平分别增加了55%和减少了41.7%。与模型组相比，阳性药治疗组关节滑膜组织中的AA和PGE1的水平分别减少了53.0%和增加了92.4%，追风伞低剂量组关节滑膜组织中的AA和PGE1的水平分别减少了12.8%和增加了25.2%，追风伞中剂量组关节滑膜组织中的AA和PGE1的水平分别减少了27.7%和增加了49.0%，追风伞高剂量组关节滑膜组织中的AA和PGE1的水平分别减少了22.5% 和增加了71.9%。对于AA，各治疗组之间无显著性差异；
对于PGE1，低、高剂量组之间存在显著性差异。
图4 大鼠关节滑膜中PDGF-A（A）、VEGFA（B）、IGF 1（C）、FGF-2（D）、HGF（E）、TGFβ1（F）、PPP2R5C（G）、FXR1（H）和TNF-α（I）的表达水平（n=10）
2.3 大鼠滑膜组织的病理学分析
组织病理学分析（如图2）表明，在空白组的关节滑膜组织中，细胞单层排列且未发现异常的炎性细胞。模型组的大鼠关节滑膜组织中发生了严重的炎症反应，滑膜明显增生，细胞排列不规则，炎性细胞浸润。阳性药治疗组和追风伞治疗组的滑膜损伤较轻，滑膜增生被抑制，炎症反应被逆转。
2.4 大鼠关节滑膜组织中 Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表达水平
与空白组相比（如图3），模型组中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表达水平分别增加了2913.0%、154992.0%、11280.0%、380.5% 和 213499.5%。与模型组相比，阳性药治疗组中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表达水平分别减少了97.7%、95.1%、99.6%、78.9%和67.4%，追风伞低剂量组中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表达水平分别减少了58.3%、29.0%、96.9%、22.0%和20.2%，追风伞中剂量组中的 Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表达水平分别减少了79.5%、56.1%、96.6%、53.5%和91.7%，追风伞高剂量组中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表达水平分别减少了98.7%、79.5%、77.1%、98.4%和98.6%。对于Itga2b、Itgb3及EIF4B，各治疗组之间有显著性差异；
对于eEF1A2和EIF2B2，高剂量组分别与低中剂量组之间存在显著性差异。
2.5 大鼠关节滑膜中PDGF-A、VEGFA、IGF 1、FGF-2、HGF、TGFβ1、PPP2R5C、FXR1和 TNF-α 的表达水平
与空白组相比（如图4），模型组的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表达水平分别增加了197.1%、170.7%、208.7%和151.0%，模型组的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表达水平分别减少了83.2%、60.6%、65.3%、61.4%和69.0%。与模型组相比，阳性药治疗组的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表达水平分别减少了53.0%、58.5%、60.7%和54.1%，阳性药治疗组的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表达水平分别增加了379.4%、130.8%、139.4%、103.5%和129.9%，追风伞低剂量组的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表达水平分别减少了24.3%、10.8%、16.2%和20.3%，追风伞低剂量组的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表达水平分别增加了135.8%、34.0%、42.9%、2.8%和46.3%，追风伞中剂量组的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表达水平分别减少了38.3%、21.5%、29.1%和31.4%，追风伞中剂量组的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表达水平分别增加了241.1%、77.6%、76.1%、45.3%和66.2%，追风伞高剂量组的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表达水平分别减少了46.4%、50.8%、50.1%和47.9%，追风伞高剂量组的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表达水平分别增加了348.2%、100.2%、138.2%、88.9% 和 124.3%。对于 PDGF-A、VEGFA、HGF、TGFβ1、PPP2R5C、FXR1和 TNF-α，低、高剂量组之间存在显著性差异；
对于IGF 1，高剂量组分别与低中剂量组之间存在显著性差异；
对于FGF-2，各治疗组之间无显著性差异。
关节内注射碘乙酸钠是一种常用的骨关节炎模型的造模方式[8]。实验结果表明，碘乙酸钠可以对关节滑膜造成严重损伤。前期研究已经表明，碘乙酸钠能诱导关节滑膜中的炎症、细胞凋亡和血小板聚集[3,9-10]。
3.1 追风伞抑制骨关节炎中的滑膜炎症
骨关节炎是一种发生在滑膜关节的炎症疾病。碘乙酸钠促进炎症细胞浸润到关节滑膜中，并诱导炎症反应，从而进一步导致滑膜增生和关节肿胀。追风伞可以减轻炎症细胞在滑膜中的浸润，从而减轻随后由炎症反应诱导的滑膜和关节病变。此外，前期生物标签研究也表明了，AA是追风伞在滑膜细胞中的敏感靶点[2]。AA的异常表达能引起滑膜炎症，并易于诱发骨关节炎[11]。追风伞治疗组具有能抑制滑膜中AA表达的趋势。
3.2 追风伞调节骨关节炎滑膜细胞凋亡
细胞凋亡在骨关节炎的发病机制中起到关键的作用[1]。前期的研究发现[3]，FXR1和TNF-α的异常表达参与了碘乙酸钠诱导的细胞凋亡的过程。然而，在模型组中，PPP2R5C（一种抗凋亡蛋白）也发生高表达，这可能是滑膜细胞抵抗碘乙酸钠诱导的细胞凋亡的自我保护机制。追风伞可以逆转这些蛋白质的异常表达，这有助于骨关节炎滑膜中的抗凋亡和促凋亡过程恢复平衡。
3.3 追风伞抑制骨关节炎滑膜中血小板的聚集
骨关节炎滑膜中血小板的数量增加及激活是炎症反应的标志物[5]。激活的血小板能诱导滑膜微循环血栓的形成及软骨损伤[12]。前期研究表明，追风伞干预的关节滑膜中的4个生物标签与血小板聚集过程有紧密联系[2-3]。Itga2b和Itgb3主要在血小板中表达，它们的表达水平可以代表血小板的数量[3]。与此同时，这两个蛋白质的过表达也可以促进血小板聚集[3]，这与前期研究的结果是相一致的[3]。前期研究也表明了，追风伞可以增加滑膜中PGE1的表达水平，这有助于抑制碘乙酸钠诱导的血小板聚集[2]。在本研究中，追风伞可以逆转上述由碘乙酸钠诱导的生物标签的异常表达。此外，AA也可以诱导血小板聚集[13]。追风伞对AA表达的抑制也有助于减轻碘乙酸钠诱导的血小板聚集。
血小板会释放一些生长因子，它们在骨关节炎的发病过程中表达异常[14]。在本研究中，碘乙酸钠在诱导滑膜中血小板聚集的同时，也影响了其中6种生长因子的表达。骨关节炎中PDGF-A和IGF1的表达上调在促进滑膜增生和增强滑膜细胞对炎症介质的反应中发挥作用[15-16]。前期研究表明，HGF和VEGFA的表达呈正相关性，且两者都是重要的血管生成因子[17]。血管生成是创伤愈合过程中的关键步骤[18]。因此，模型组中HGF和VEGFA的表达不足不利于滑膜损伤的修复。滑膜细胞中的；
TGFβ1和FGF-2具有软骨保护作用[19-20]，它们能促进软骨的修复。模型组中的；
TGFβ1和FGF-2的表达不足不利于骨关节炎软骨损伤的修复。追风伞能逆转由碘乙酸钠诱导的生长因子的失调，这有助于骨关节炎中滑膜和软骨损伤的修复。
3.4 追风伞调节骨关节炎滑膜中的蛋白质合成功能障碍
前期生物标签研究结果显示，eEF1A2、EIF2B2和EIF4B是追风伞干预关节滑膜的敏感靶点[3]。EIF2B2和EIF4B是蛋白质合成过程中的翻译起始因子，eEF1A2是翻译延伸因子[3]。有研究表明，eEF1A2和EIF4B的异常表达参与了骨关节炎的发病机制[21-22]。在骨关节炎的滑膜和软骨中，蛋白质合成异常[23-24]。本研究表明，碘乙酸钠可以引起滑膜中上述蛋白质的表达失调，因此，碘乙酸钠也可以用于骨关节炎中滑膜的蛋白质合成功能障碍的机制和治疗的研究。
在本研究中，碘乙酸钠上调了eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表达水平，这有利于蛋白质的合成。可能是由于碘乙酸钠诱导关节滑膜损伤后，滑膜细胞产生的自我保护机制，从而增加蛋白质合成过程的效率，促进细胞和组织的修复和重建[3]。以上内容提示了，追风伞可通过多种途径来减轻碘乙酸钠诱导的滑膜损伤，进一步减少滑膜组织的自我修复和自我重建的需求，因此缓解了蛋白质的过度合成。追风伞抑制了这些蛋白质的表达。
本研究表明，追风伞可以减轻碘乙酸钠诱导的骨关节炎模型的关节肿胀和滑膜损伤。其机制可能涉及炎症、细胞凋亡、血小板聚集和蛋白质合成功能障碍，这为后续追风伞治疗骨关节炎的物质基础的研究奠定基础，为其在骨关节炎的临床应用提供了重要的依据。
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