王冬梅，袁宝军，高利常，袁伟
结缔组织病（connective tissue disease，CTD）是以结缔组织和血管慢性炎症为病理基础的一组自身免疫性疾病，其并发症较多，当CTD患者肺部受累时常表现为间质性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）［1］。结缔组织病相关间质性肺疾病（CTD-ILD）起病隐匿，主要依据临床表现及肺部高分辨CT（HRCT）诊断，患者就诊时多属中晚期，已错过了最佳的治疗时机，病死率高。因此，寻找早期特异性血清标志物对于早发现、早诊断和治疗CTD-ILD具有重要的临床意义。甲壳质酶蛋白40（chitinase protein 40，YKL-40）是一种分泌型糖蛋白，具有参与炎症、细胞增殖和组织重塑的多效生物活性，已被证实可用于评估多种自身免疫疾病的活动性与严重程度［2-3］。而趋化因子配体18（chemokine ligand 18，CCL18）为CC族趋化因子，在机体免疫应答和炎症反应中发挥重要作用［4］。近几年国内外研究报道，YKL-40可能参与肺纤维化过程［5-6］，特发性肺纤维化患者血清中CCL18水平与肺纤维化程度相关［7］。本研究通过分析CTD-ILD患者血清中YKL-40和CCL18水平变化情况，探讨其在CTD-ILD患者诊断及病情严重程度评估中的应用价值。
1.1 研究对象 以2018年3月—2019年8月开滦总医院住院确诊的105例CTD患者为研究对象，其中男21例，女84例，年龄20~79岁，平均（55.21±1.67）岁，病程2个月~21年。其中系统性红斑狼疮（SLE）29例，类风湿性关节炎（RA）24例，混合性结缔组织疾病（MCTD）20例，系统性硬皮症（SSc）10例，原发性干燥综合征（SS）12例，系统性血管炎（SV）6例，多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM）4例。纳入标准：（1）所有患者入院3 d内进行肺部HRCT检查。（2）SLE符合2009年系统性狼疮国际协作组（SLICC）修订的由美国风湿病学会（ACR）提出的诊断标准；
RA符合2010年ACR/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）制定的诊断标准；
MCTD符合1987年Gordon Sharp诊断标准；
SSc符合2013年ACR/EULAR制定的诊断标准；
SS符合2002年原发性干燥综合征国际（分类）诊断标准；
SV符合1994年Chapel Hill分类诊断标准；
PM/DM符合1975年Bohan/Peter提出的诊断标准。（3）符合CTD-ILD诊断标准。确诊为CTD，同时符合以下2项或2项以上指征，即出现咳嗽、气短、胸痛、呼吸困难等典型的呼吸道症状，肺功能检测通气障碍或弥散性功能不全，HRCT检查出现1项以上间质性肺炎的影像学改变，肺部活检表现为间质性病变，无感染依据且抗感染治疗5~7 d后无效。排除标准：（1）放射性肺炎、过敏性肺炎、药物性肺炎、特发性肺纤维化、硅沉着病、石棉沉着病导致的间质性肺疾病。（2）合并冠状动脉血管性疾病以及肾脏透析的患者。（3）存在脑血管、消化、内分泌及造血系统等原发疾病的患者。
根据患者临床症状及肺部HRCT检查结果，37例患者出现ILD（CTD-ILD组），其中男8例，女29例，年龄32~75岁，平均（56.51±10.93）岁，病程8个月~20年。另68例未合并ILD的CTD患者（CTD组），同时选择年龄、性别匹配的35例健康体检者作为对照组。3组受试对象一般临床资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1、2。本研究经我院伦理委员会批准（伦理号：2020040），患者均签署知情同意书。
Tab.1 Analysis of general information in the studied people表1 研究对象的一般资料分析
Tab.2 Comparison of primary disease classification between the CTD-ILD group and the CTD group表2 CTD-ILD组与CTD组原发病分类比较［例（%）］
1.2 方法
1.2.1 资料收集 详细记录研究对象的性别、年龄、病程、是否吸烟、是否使用激素、免疫抑制剂使用情况等临床资料，并记录白细胞计数（WBC）、血红蛋白（Hb）、血小板（PLT）、血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白（Ig）A、IgG、IgM、补体C3、癌胚抗原（CEA）等实验室检查结果及肺部HRCT影像学表现。
1.2.2 血清YKL-40和CCL18检测 所有研究对象均清晨空腹采集静脉血3 mL，室温静置1 h后，3 000 r/min（离心半径17.5 cm）低温离心10 min，提取血清放入EP管中后，置-20℃冰箱保存，待统一测定。检测试剂盒购自美国R&D公司，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行检测。所有试剂使用前均平衡至室温，测定严格按各操作说明书执行。所用仪器为瑞士Tecan公司生产的sunrise型号酶标仪，测定结果依据标准品的浓度及对应的光密度（OD）值绘制标准曲线，得到直线回归方程，再依据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。
1.2.3 肺部HRCT评分 采用美国GE公司Revolution 256排螺旋CT设备对CTD-ILD患者进行肺部扫描。按Müller评分法［8］进行肺部HRCT评分：选择主动脉弓、气管分叉和膈顶上方1 cm共3个层面，按照磨玻璃影改变、网格影改变和蜂窝影的改变程度记分；
无改变，0分；
病变范围≤5%，1分；
病变范围6%~24%，2分；
病变范围25%~49%，3分；
病变范围50%~75%，4分；
病变范围＞75%，5分；
将3种改变评分累加后计算总分。由放射科2位副主任及以上级别的医师进行HRCT评分并取其平均值。
1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行数据分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，2组均数比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验；
偏态分布的计量资料以中位数和四分位数［M（P25，P75）］表示，2组间比较采用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，组间多重比较通过Bonferroni法校正检验水准；
计数资料比较采用χ2检验；
各指标的诊断性能采用受试者工作特征（ROC）曲线分析，危险因素分析采用多因素Logistic回归，相关性采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 3组研究对象血清中YKL-40和CCL18水平比较 CTD-ILD组血清中YKL-40和CCL18水平明显高于CTD组和对照组，CTD组血清中YKL-40水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而CTD组血清中CCL18水平与对照组差异无统计学意义，见表3。
2.2 CTD-ILD组和CTD组实验室指标比较 CTDILD组血清CEA水平明显高于CTD组（P＜0.01），其他实验室指标比较差异均无统计学意义，见表4。
2.3 CTD患者发生ILD的危险因素分析 以ILD是否发生作为因变量（发生ILD=1，未发生ILD=0），将YKL-40、CCL18、CEA作为自变量，多因素Logistic回归分析显示，YKL-40和CCL18升高是CTD患者发生ILD的独立危险因素（P＜0.05），见表5。
Tab.3 Comparison of serum YKL-40 and CCL18 levels between the three groups表3 3组研究对象血清中YKL-40和CCL18水平比较［ng/L，M（P25，P75）］
Tab.4 Comparison of clinical laboratory indicators between the CTD-ILD group and the CTD group表4 CTD-ILD组与CTD组实验室指标比较
Tab.5 Multivariate Logistic regression analysis of ILD in CTD patients表5 CTD患者发生ILD的多因素Logistic回归分析
2.4 血清YKL-40、CCL18水平对CTD-ILD的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，血清YKL-40水平对CTD-ILD有诊断价值（P＜0.05），最佳截断值为4 484.6 ng/L；
血清CCL18水平对CTD-ILD诊断价值有限（P＞0.05）；
YKL-40联合CCL18对CTD-ILD有诊断价值（P＜0.05），且联合诊断的敏感度高于YKL-40与CCL18单独诊断，见图1、表6。
Fig.1 ROC curve of serum YKL-40 and CCL18 levels in the diagnosis of CTD-ILD图1 血清YKL-40和CCL18对CTD-ILD诊断价值的ROC曲线
Tab.6 ROC curve analysis results of serum YKL-40 and CCL18 levels in the diagnosis of CTD-ILD表6血清YKL-40和CCL18水平对CTD-ILD诊断价值的ROC曲线分析结果
2.5 血清YKL-40、CCL18水平与肺部影像学改变的相关分析 CTD-ILD患者的肺部HRCT评分平均为（2.68±0.37）分。CTD-ILD患者血清中YKL-40、CCL18水平与肺部HRCT评分均呈正相关（rs分别为0.697、0.472，均P＜0.05）。
ILD是一组以肺泡炎症和间质纤维化为基本病变的弥漫性肺疾病，其病因多样，包括环境因素、职业、药物、免疫反应等。其中CTD是通过自身免疫反应引起ILD的主要病因之一［9］。有学者认为，由于CTD患者免疫系统紊乱导致巨噬细胞和淋巴细胞活化，从而释放多种细胞因子，造成肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞间基底膜的损伤、异常纤维母细胞增生、炎症及细胞外基质成分的沉积等［10］。目前临床上对CTD-ILD的诊断主要依靠其临床特征、肺部HRCT及组织病理学检查，但这不利于疾病的早期诊断，且费用较高。因此，寻找相对特异和敏感的生物标志物是早期诊断、优化治疗及改善CTD-ILD患者预后的关键。
YKL-40是由活化的巨噬细胞和中性粒细胞等多种细胞分泌的炎性糖蛋白，具有调节炎症的作用，属于几丁质酶成员，分子质量为40 ku，因其N端起始氨基酸为酪氨酸（Y）、赖氨酸（K）和亮氨酸（L），故被称为YKL-40，可作为急慢性炎症相关标志物，在气管重塑和组织纤维化中发挥重要作用［11］。近年来，YKL-40被认为是诊断ILD和判断预后的生物标志物，尤其是特发性肺纤维化和结节病［12-13］。有研究发现，PM/DM-ILD患者血清YKL-40水平显著高于健康对照，表现为YKL-40在PM/DM-ILD患者聚集的肺泡内巨噬细胞和过度增殖的肺泡上皮细胞中表达增强，血清高水平YKL-40是患者不良预后的独立危险因素［14］。SSc合并ILD患者血清中YKL-40水平也较正常对照组升高［15］。本研究结果显示，CTD-ILD组血清中YKL-40水平明显高于CTD组和对照组，提示YKL-40作为结缔组织的细胞生长因子与多种自身免疫性疾病的活动性或严重程度有关，且其作为机体炎症反应因子可能参与CTD-ILD患者的肺部炎症、组织重塑或纤维化过程，与相关研究报道基本一致［16-17］。
CCL18又称肺活化调节趋化因子，属CC族趋化因子，主要由肺组织中的树突状细胞和巨噬细胞表达，由Th2型细胞因子如白细胞介素（IL）-4、IL-10和IL-13等激活，在炎症刺激时表达明显升高。CCL18可诱导肺成纤维细胞胶原合成，进而导致肺纤维化和肺功能的下降［18］。Kodera等［19］比较了SSc-ILD患者中血清CCL18水平，发现SSc-ILD患者血清CCL18水平升高，且与一氧化碳弥散量（DLCO）和用力肺活量（FVC）呈负相关。Hoffmann-Vold等［20］通过一项前瞻性研究发现，SSc-ILD患者的血清中CCL18血清水平越高，肺纤维化进展越重，可以作为预测SSc-ILD疾病进展的生物标志物。本研究结果显示，CTD-ILD组血清中CCL18水平明显高于CTD组和对照组，提示CTD-ILD组患者中肺泡巨噬细胞激活，CCL18产生增加，血清中CCL18明显升高，可能与患者的肺纤维化重塑有关，与Cai等［21］的研究报道基本一致。此外，本研究结果还显示，与对照组比较，CTD组患者血清中YKL-40水平明显增高，而CCL18水平有增高趋势但不显著，推测YKL-40和CCL18可能对CTD患者发生ILD的早期筛查有一定意义。
本研究通过多因素Logistic回归分析显示，血清YKL-40和CCL18升高是CTD患者发生ILD的独立危险因素；
ROC曲线分析结果显示，血清YKL-40水平对CTD-ILD有诊断价值，而CCL18血清水平对CTD-ILD诊断价值有限，YKL-40联合CCL18诊断CTD-ILD的价值高于YKL-40和CCL18单独诊断。因此，血清YKL-40有望成为诊断CTD-ILD的血清标志物，且YKL-40和CCL18联合检测更有助于CTD-ILD患者的早期诊断。贺新伟等［22］研究发现，CTD-ILD患者肺泡灌洗液中CCL18水平升高，可能与肺部病变严重程度及住院期间预后相关，CCL18是潜在的CTD-ILD疾病严重性及预后的标志物。本研究显示，CTD-ILD患者血清YKL-40、CCL18水平与肺部HRCT评分均呈正相关，提示CTD-ILD患者血清中YKL-40和CCL18水平可能随着肺部组织病变加重而增加，检测血清YKL-40和CCL18水平有助于患者的病情评估。
综上所述，CTD-ILD患者血清中YKL-40和CCL18水平显著升高，两者均是CTD患者发生ILD的独立危险因素，可作为简单易行且可重复检测的血清标志物；
两者联合检测有助于CTD-ILD早期诊断及病情评估。由于本次研究对象均为住院患者，以CTD急性加重与CTD-ILD加重原因入院，YKL-40和CCL18在疾病稳定期是否也存在相同变化，还需要今后继续探究。
